Kultur mikroorganisme yang digunakan dalam pengujian media tentunya memiliki berbagai persyaratan dalam preparasi dan penyimpanannya untuk menjamin hasil pengujian media yang meyakinkan. Jenis mikroorganisme yang digunakan (kultur uji positif dan negatif) juga harus sesuai. Oleh karena itu, diperlukan suatu prosedur penanganan kultur referensi ini.

Gambar 1. Bagan penanganan kultur uji. Culture stock dapat berbentuk freeze dried ampoule, gliserol beku atau beads. Diadaptasi dari “Guideline for assuring quality of medical microbiological media”, oleh ASM (Australia Society Microbiology), 2012, hal 10.

Kultur mula-mula dapat diperoleh dengan membeli CRM (Certified Reference Material) kualitatif yaitu kultur bakteri strain tertentu yang diketahui karakteristiknya dan tersertifikasi. Bakteri ini disebut reference strain (ISO) atau master culture (ASM) yang biasanya dalam bentuk hasil liofilisasi. Reference strain ini harus dikultur terlebih dahulu ke dalam media yang sesuai untuk diperbanyak dan dapat disimpan dalam waktu yang lama. Kultur ini disebut sebagai reference stock (ISO) atau culture stock (ASM). Bakteri kontrol uji siap pakai didapat dengan mengambil koleksi reference stock dari freezer dan mengkulturnya pada media yang sesuai, kultur generasi ketiga ini disebut dengan working culture. Kinerja media dikontrol menggunakan working culture ini. Working culture harus disimpan dalam refrigerator yang terpisah dari media siap pakai untuk menghindari kontaminasi silang. Working culture dan reference stock tidak dapat digunakan kembali sebagai reference strain. Menurut NCTC (2015), sebaiknya biakan bakteri tidak disubkultur lebih dari generasi ke-4 karena dapat menyebabkan variasi genetik (hal. 24). Prosedur secara umum dapat dilihat pada Gambar 1 sedangkan bagan penanganannya dijelaskan pada Gambar 2. Terdapat sedikit perbedaan istilah dalam penyebutan tahap kultur kontrol uji tetapi prinsip penggunaannya adalah sama. ISO 11133: 2014 memberikan pilihan pada tahap generasi ketiga yaitu dapat dibuat stock culture dari working culture, namun pilihan 2 ini tidak lebih disarankan dibandingkan pilihan 1 (lihat Gambar 2).

Gambar 2. Bagan penanganan kultur uji dari reference strain menjadi reference stock, stock culture dan working culture berdasarkan interpretasi ISO 11133:2014 (Annex B). Disarankan untuk menggunakan jalur pilhan 1 dibandingkan pilihan 2. Diambil dari dokumentasi pribadi.

Dalam pengujian kuantitatif seperti produktivitas diperlukan suatu suspensi bakteri yang telah diketahui jumlahnya (misalnya 80-120 CFU/0,1 mL). Inokulum ini dapat diperoleh dengan membeli atau membuat sendiri dari bakteri kontrol yang telah teridentifikasi jenisnya. Schijven, Havelaar dan Bahar (1994) menyarankan suatu prosedur untuk penyiapan inokulum kuantitatif ini. Bakteri uji disuspensikan ke dalam skim milk lalu dibekukan secara cepat pada dry ice–ethanol kemudian disimpan pada -70 °C. Suspensi ini dapat digunakan sebagai bakteri kontrol dengan mencairkannya kembali pada 37 °C dengan cepat. Suspensi akan tetap homogen dan stabil dalam waktu paling tidak setahun kecuali Aeromonas hydrophyla yang akan menurun jumlahnya 20-30 % dalam setahun (hal. 4160). Referensi ini disarankan oleh ISO 11133: 2014 untuk pembuatan RM (Reference Material) yang diproduksi secara internal sehingga laboratorium tidak perlu membeli CRM yang pada umumnya berharga mahal. Inokulum dapat ditumbuhkan dari reference strain sehingga didapatkan reference stock simpanan yang diketahui jumlahnya. Namun cara ini memerlukan perhatian khusus dalam pengujian stabilitas dan homogenitas suspensi ini saat penyimpanannya karena tidak dijamin seperti halnya CRM.

Indra Pradhika, 2018

Referensi

Australia Society Microbiology. (2012). Guideline for assuring quality of medical microbiological media (Edisi ke-2). Diperoleh dari: http://www.theasm.org.au/assets/ASM-Society/Guidelines-for-the-Quality-Assurance-of-Medical-Microbiological-culture-media-2nd-edition-July-2012.pdf

ISO 11133: 2014 Microbiology of food, animal feed and water — Preparation, production, storage and performance testing of culture media. (2014).

National Collection of Type Culture. (2015). National Collection of Type Culture, Authenticated Bacterial Reference and Type Strain. Public Health England. Diperoleh dari: https://www.phe-culturecollections.org.uk/media/103033/nctc-brochure-4mb-final.pdf

Schijven, J. F., Havelaar, A. H., & Bahar, M. (1994). A simple and widely applicable method for preparing homogeneous and stable quality control samples in water microbiology. Appl. Environ. Microbiol. 1994, 60 (11), 4160–4162. Diperoleh dari: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC201951/