Pengenceran Bertingkat
Pengenceran bertingkat adalah tahap analisis laboratorium yang berfungsi untuk mengencerkan jumlah mikroorganisme di dalam sampel (jika diperkirakan sangat padat) dengan perbandingan pengenceran 1:9 sehingga diperoleh pengenceran 1/10 untuk setiap tingkat pengencerannya. Perbandingan lain juga dapat diaplikasikan, misalnya 1:2 atau 1:5.
Pengenceran pertama (Initial suspension/primary dilution) adalah suspensi, larutan atau emulsi yang diperoleh setelah menimbang atau mengukur kuantitas suatu produk sebelum diuji (atau sampel uji yang dipersiapkan dari produk) yang telah dicampur dengan pengencer sebanyak sembilan kali lipatnya sehingga jika terdapat partikel besar dapat terendapkan. Sedangkan pengenceran bertingkat selanjutnya (further decimal dilution) adalah suspensi atau larutan yang diperoleh dengan mencampur volume yang terukur dari pengenceran pertama dengan volume sembilan kali lipatnya dan dengan mengulangi cara ini dengan pengenceran desimal selanjutnya sampai diperoleh pengenceran yang cocok untuk inokulasi (ISO 6887-1, 1999, hal. 1).
1. Pemilihan Larutan Pengencer
Berbagai cairan pengencer dapat dijumpai pada Tabel 1. Diluent ini dapat dengan bebas dipilih sesuai kegunaannya. Namun jika metode yang dirujuk menyebutkan nama cairan pengencer tertentu maka sebaiknya tetap memakai cairan pengencer tersebut.
Tabel 1. Berbagai larutan pengencer yang dapat dipilih untuk digunakan dalam pengenceran bertingkat. Diolah dari ISO 6887-1 (1999);6887-2 (2003); ISO 8199 (2005); AOAC OM 966.23 (2005).
| Nama | Komposisi / L | pHa | Keterangan | Sumber |
|---|---|---|---|---|
| Peptone salt solution | enzymatic digest of casein (1 g)
NaCl (8,5 g) Air (1000 mL) |
7,0 ±0,2 | Digunakan secara umum | ISO 6887-1 (hal. 2) |
| Buffered peptone water | enzymatic digest of animal tissue (10 g)
NaCl (5 g) Na2HPO4·12H2O (9 g) KH2PO4 (1,5 g) Air (1000 mL) |
7,0 ±0,2 | Digunakan secara umum | ISO 6887-1 (hal. 3) |
| Peptone salt solution dengan bromcresol purple | enzymatic digest of casein (1 g)
NaCl (8,5 g) bromcresol purple (0,04% larutan alkohol) (0,1 mL) Air (1000 mL) |
– | Digunakan secara khusus. Larutan ini dapat diaplikasikan pada sampel asam sehingga pengaturan pH memakai probe pH steril tidak perlu dilakukan.b | ISO 6887-2, (hal. 3-4) |
| Saline solution | NaCl (8,5 g)
Air (1000 mL) |
7,0 ±0,5 | Digunakan secara umum untuk sampel air | ISO 8199, (hal. 3) |
| Peptone diluent | enzymatic digest of casein (1 g)
Air (1000 mL) |
7,0 ±0,5 | Digunakan secara umum untuk sampel air | ISO 8199, (hal. 4) |
| Ringer’s solution, quarter strength | NaCl (2,25 g)
KCl (0,105 g) CaCl2 (0,12 g) NaHCO3 (0,05 g) Air (1000 mL) |
7,0 ±0,2 | Digunakan secara umum untuk sampel air | ISO 8199, (hal. 4) |
| Phosphate buffer solution | Larutan Ac:
KH2PO4 (34 g) Air (1000 mL) Larutan B.: MgCl2 (38 g) Air (1000 mL) Larutan akhir: Lar. A (1,25 mL) Lar. B (5 mL) Air (1000 mL) |
7,0 ±0,2 | Digunakan secara umum untuk sampel air | ISO 8199, (hal. 4) |
| Butterfield buffered phosphate diluent | Larutan Ac:
KH2PO4 (34 g) Air (1000 mL) Larutan akhir: Lar. A (1,25 mL) Air (1000 mL) |
7,2 | Digunakan secara umum untuk sampel pangan | AOAC OM 966.23 |
| a nilai pH pada suhu 25°C. pH dapat diatur dengan meambahkan NaOH 1 mol/L atau HCl 1 mol/L.
b penambahan NaOH pada larutan ini setelah dihomogenisasikan dengan sampel asam sering diperlukan sehingga pH kembali netral. Penambahan NaOH tergantung kepada keasaman sampel. Konsentrasi yang paling sesuai (misalnya 0,1 mol/L atau 1 mol/L) adalah konsentrasi yang masih dekat dengan perbandingan 1:9 dengan pelarut (ISO 6887-4, 2003, hal. 5). Bromcresol purple akan berwarna kuning jika asam dan berwarna ungu jika pH diatas 6,8. c dibuat dengan melarutkan bahan terlebih dahulu pada air 500 mL lalu pH diatur menggunakan 175 mL 1M NaOH. Kemudian diencerkan dengan air sampai 1000 mL. |
||||
ISO 8199 (2005) menyatakan bahwa cairan pengencer dapat disimpan pada suhu 5±3 °C selama maksimum 6 bulan dan dapat dibagikan ke tabung atau botol setelah atau sebelum sterilisasi (hal. 2-4).
King dan Hurst (1963) melaporkan bahwa larutan pengencer yang paling baik adalah 0,1 % peptone solution. Sedangkan larutan air + 0,1 % Na2S2O3 menghasilkan data yang lebih tidak memuaskan. Namun larutan quarter–strength ringer solution, 0,85% NaCl dan air destilasi menunjukkan sifat bakterisidal kepada satu atau lebih dari 4 spesies bakteri yang diuji (hal. 504). Sedangkan McFetters et al. (1982) juga menunjukkan bahwa larutan peptone water dan phosphate buffer + 0,1 % peptone adalah pengencer yang paling stabil dibandingkan yang lain yaitu mampu menghasilkan recovery antara 80-90 % untuk jenis Coliform (hal. 99), seperti yang ditunjukkan pada Grafik 1. Straka dan Stokes (1956) juga merekomendasikan 0,1 % peptone sebagai larutan pengencer untuk mempertahankan bakteri paling tidak selama 1 jam karena telah membuktikan bahwa air destilasi akan mengurangi 90 % jumlah bakteri dalam 1 jam dan phosphate water juga dapat mematikan 80 % dalam waktu yang sama (hal. 24). Oleh karena itu, dari beberapa studi diatas (jika tidak mengikuti syarat metode baku terkait) perlu dipertimbangkan menggunakan larutan peptone 0,1 % atau yang mengandung peptone 0,1 % untuk menghasilkan larutan yang mampu mempertahankan bakteri hidup tanpa mereplikasinya dan memulihkan bakteri yang terluka.
Grafik 1. Pengaruh jenis larutan pengencer dan lama pemaparan pada recovery bakteri E.coli yang terluka (90%) dan tidak terluka pada suhu 24 °C. Diadaptasi dari” Influence of diluents, media, and membrane filters on detection of injured waterborne coliform bacteria.”, oleh McFetters et al., 1982, hal. 99.
2. Prosedur pengenceran
Cairan pengencer yang telah siap sebaiknya dibagikan ke dalam tabung atau labu berpenutup ulir dengan volume 9,0 mL setelah sterlisasi. Volume akhir ini harus tidak melebihi ±2 %. Pemindahan cairan saat pengenceran sebaiknya menggunakan pipet ukur 1 dan 10 mL dengan skala 0,1 mL dan 0,5 mL (ISO 6887-1, hal. 3-4). Air yang digunakan sebaiknya memiliki karakterstik sesuai dengan persyaratan pembuatan media.
ISO 6887-1 (1999) merekomendasikan tahap-tahap pengenceran yaitu :
- Sampel ditimbang (m) atau diambil volume (V) di dalam plastik steril atau mangkuk steril dengan ketidakpastian ±5 %.
- Cairan pengencer sebanyak 9×m (g) atau 9×V (mL) ditambahkan pada sampel. Dapat dimungkinkan untuk menambahkan cairan pengencer lebih dari 1:9 jika larutan pada pengenceran pertama menunjukkan masih terlalu kental. Penambahan ini tentunya harus dimasukkan dalam perhitungan akhir. Selain itu, pengenceran pertama ini memiliki pengaruh terhadap LOD suatu metode dan juga tergantung pemilihan teknik inokulasi (spread plate atau pour plate). Jika diperlukan, cairan pengencer dapat ditambahkan dibawah ketentuan 1:9 yang berfungsi untuk meningkatkan batas pendeteksian tersebut. Volume diluent yang berbeda ini harus dilaporkan ke dalam laporan akhir.
- Pencegahan kerusakan mikroorgansime karena perubahan suhu yang mendadak dapat dihindari dengan mengaklimatisasi suhu pengencer ke dalam suhu ambien.
- Partikel sampel yang berukuran besar sebaiknya dibiarkan mengendap. Jika diperlukan dapat ditunggu sampai 15 menit.
Pengenceran bertingkat selanjutnya:
- 1 mL dari pengenceran pertama dipindahkan dengan pipet (ketidakpastian pengukuran ±5 %) ke dalam tabung yang mengandung 9 mL pengencer pada suhu yang sesuai. Jika diperlukan, volume yang dipindahkan dapat diperbesar dan dengan volume pengenceran selanjutnya sebanyak 9 kali lipatnya.
- Sebaiknya pipet jangan dimasukkan lebih dari 1 cm ke dalam pengencer pertama untuk mencapai presisi yang optimal dan dilakukan pencegahan kontak antara pipet yang mengandung inokulum dengan pengencer steril.
- Setelah dimasukkan, maka larutan dicampur menggunakan stirrer mekanik (vortex) selama 5-10 detik untuk mendapatkan pengenceran 1/100. Jika diperlukan cara ini dapat diulangi sampai mendapatkan tingkat pengenceran yang sesuai.
Waktu yang diperlukan untuk mengerjakan tahap persiapan pengenceran pertama sampai diinokulasikan ke medium sebaiknya tidak melebihi 45 menit. Sedangkan waktu yang direkomendasikan untuk melakukan tahap pengenceran pertama sampai akhir pengenceran bertingkat adalah selama 30 menit. Jika suhu ambien di laboratorium cukup tinggi, maka batas waktu pengerjaan tersebut sebaiknya dipersingkat (hal. 4-5) (lihat Gambar 2). Pembatasan waktu pengenceran ini dilakukan untuk menjaga bakteri pada suspensi tidak bertambah dan tidak berkurang.
Gambar 2. Tahap-tahap proses pengenceran pada pengenceran pertama dan pengenceran selanjutnya berdasarkan interpretasi dari ISO 6887-1 (1999). Diambil dari dokumentasi pribadi.
Dapat digarisbawahi pada prosedur diatas bahwa disarankan untuk mengendapkan dahulu pengenceran pertama selama 15 menit yang berfungsi untuk memisahkan partikel besar sampel dengan larutan yang mengandung mikroorganisme. Setelah perlakuan pendiaman tersebut dimungkinkan sel mikroorganisme akan tetap terlarut di diluent sedangkan partikel sampel akan mengendap. Selain itu, fungsi lainnya adalah untuk menyadarkan (resuscitation) mikrob yang stress pada sampel dan menghilangkan busa yang terbentuk pada jenis sampel tertentu. Namun, terdapat pandangan lain dalam pengenceran ini, yaitu pengenceran pertama harus dikocok/dihomogenkan dahulu bersama partikel sampel sampai sesaat sebelum dipindahkan oleh pipet (tanpa didiamkan) untuk mendapatkan distribusi sampel yang seragam karena dimungkinkan terdapat mikroorganisme dalam partikel tersebut yang tidak terambil jika diendapkan. Jadi partikel sampel harus ikut terisap oleh pipet saat partikel tersebut berada dalam kondisi tersebar merata sebelum mengendap. Cara kedua ini lebih berisiko karena keberadaan partikel sampel dapat dimungkinkan menghambat pertumbuhan. Ilustrasi perbedaan ini dapat diperhatikan pada Gambar 3. Hartman dan Huntsberger (1961) menunjukkan tidak adanya perbedaan yang signifikan pada jumlah hitungan cawan total dengan penanaman 1, 2, 3, 4 dan 8 menit setelah proses homogenisasi dengan blender selama 2 menit. Sampel yang digunakan adalah pai ayam beku (hal. 36).
Gambar 3. Perbedaan perlakuan pengambilan homogenat pada pengenceran pertama untuk ditanam atau diencerkan lebih lanjut. Setelah partikel sampel didiamkan dan mengendap atau setelah partikel sampel dikocok dan masih tersebar. Titik putih adalah partikel sampel dan titik hitam adalah gambaran sel. Diambil dari dokumentasi pribadi.
Indra Pradhika, 2018
AOAC OM 17.2.01. 966.23 Microbiological methods, AOAC Official Method of Analysis Microbiological Methods (2005).
Hartman, P. A. & Huntsberger, D. V. (1961). Influence of subtle differences in plating procedure on bacterial counts of prepared frozen foods. Iowa agricultural and home economic experiment station, Journal paper no. J-3843 Vol. 9, 32-36. Abstrak diperoleh dari: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1057665/#
ISO 6887-1:1999 Microbiology of food and animal feeding stuffs – Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination – Part 1: General rules for the preparation of the initial suspension and decimal dilution. (1999).
ISO 6887-2: 2003 Microbiology of food and animal feeding stuffs – Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination – Part 2: Spesific rules for the preparation of meat and meat product. (2003).
ISO 8199: 2005 Water quality — General guidelines on the enumeration of microorganisms by culture. (2005).
King, W. L., & Hurst, A. (1963). A note on the survival of some bacteria in different diluents. Journal of Applied Microbiology, Vol. 26, Iss. 3, 504-506. doi: 10.1111/j.1365-2672.1963.tb04803.x
kenapa aku baru nemu website ini….. bener-bener membantu buat yang pusinng waktu praktikum. sukses selalu kak author, ini keren banget sumpah.
senang bisa membantu.
pada pendapat pengambilan sampel sesaat setelah dihomogenkan, itu bertujuan untuk mendapatkan sampel yang seragam atau beragam ya? terima kasih
seragam mas, sehingga setiap kali pengambilan memiliki probabilitas yg kurg lbh sama
Selamat pagi, izin bertanya untuk jumlah sampel pengenceran beringkat apakah ada ketentuan baku yang menyatakan jumlah sampel harus 1 gram? apakah boleh 5 gram atau 10 gram?
Terimakasih
untuk ketentuan bakunya tergantung metode standar yg diacu, misalnya 50 g porsi uji. untuk custom atau sesuai keperluan, jumlah porsi uji juga dapat berubah, tidak harus 1 g.
Kak, ini kalau sampelnya e coli berarti bentuknya padat ya sehingga harus dicairkan, apa gak ada e coli yang bentuknya cair terutama pada media NB gitu? Dan fungsi pengenceran bertingkat selain itu apa juga untuk mengurangi jumlah mikroba sehingga bila diteliti nanti bisa dapat 25-250 cfu?
untuk pertanyaan pertama saya kurang paham.
secara umum fungsi pengenceran untuk menurunkan konsentrasi sehingga memenuhi kisaran hitung tersebut.
kak mau nanya,mengapa perlu pengenceran bertingkat dalam isolasi mikroba?