Terdapat tiga batasan untuk penghitungan koloni yaitu Limit of Detection, Limit of Quantification dan Upper limit.

1. LOD (Limit of Detection)

LOD (Limit of Detection) atau batas pendeteksian adalah jumlah minimum koloni yang dapat dibedakan dari ketiadaan. LOD menggambarkan ada atau tidak adanya sel mikroorganisme dalam suatu sampel sehingga terdapat separuh kemungkinan untuk bernilai nol dan separuh kemungkinan untuk bernilai 1. Pada konsentrasi ini, sampel sangat mungkin mengandung kontaminan (ketidakmurnian). Pada batas ini suatu metode kuantitatif akan menjadi seperti metode presence/absence yang menghasilkan data ya atau tidak saja.

Menurut EPA (2009) LOD didefinisikan sebagai jumlah minimum analit yang terdeteksi dengan cara yang terpercaya (hal. 2-7). Sedangkan ISO 16140 (2003) mendeskripsikan LOD adalah lebih tinggi dari nilai Critical Level sehingga memiliki kemungkinan negatif palsu lebih dari 50%. Critical Level yaitu jumlah terkecil yang dapat terdeteksi (bukan ketiadaan atau bukan tidak ada hasil) tetapi tidak dihitung sebagai nilai yang pasti. Dibawah nilai LOD ini, tidak dapat dipastikan bahwa nilai sebenarnya adalah bukan ketiadaan (oleh karena itu pelaporan jumlah dinyatakan sebagai <1) (hal. 22). EA-4/10 (2002) mendefinisikan LOD adalah sebagai jumlah terkecil mikroorganisme yang dapat dideteksi, tetapi dengan nilai yang tidak dapat diperkirakan secara akurat (diaplikasikan untuk pengujian kualitatif). Berbeda dengan pengertian Limit of Detection, Limit of Determination adalah jumlah mikroorganisme paling rendah dalam variabel terdefinisi yang mungkin ditentukan oleh kondisi metode pengujian (diaplikasikan untuk pengujian kuantitatif) (hal. 19). Namun istilah LOD untuk analisis kuantitatif dan kualitatif dalam bahasan ini tetap mengacu kepada singkatan Limit of Detection.

Teknik plate count menggunakan penanaman pour plate dari sampel langsung (10⁰) memiliki LOD sebesar 1 CFU/ mL. Namun menurut ISO 8199 (2005), batas ini dapat ditingkatkan dengan memperbesar volume sampel yang diinokulasikan. Umumnya teknik pour plate mengizinkan sampai 5 mL per cawan dalam penanamannya. Perubahan ini memperbesar LOD menjadi 1 CFU/ 5 mL. Selain itu juga dapat dengan memperbesar jumlah penanamannya, misalnya teknik pour plate 5 mL tiap cawan yang ditanam pada 5 cawan menghasilkan LOD sebesar 1 CFU/ 25 mL. Seperti halnya pour plate, teknik spread plate juga dapat ditingkatkan batas deteksinya dengan memperbanyak volume sampel. Biasanya maksimum volume sampel yang ditanam tiap cawannya adalah 0,2 mL (hal. 25).

Gambar 1. Ilustrasi “sel” yang terdapat pada ujung tip. a) Batas LOD dapat ditingkatkan dengan menambah volume inokulum. b) Memperbesar volume inokulum juga dapat memperbesar kemungkinan mendapatkan analit. Diambil dari dokumentasi pribadi.

2. LOQ (limit of Quantification)

Jumlah koloni dalam cawan akan mengikuti poisson distribution sehingga semakin rendah jumlah koloni maka semakin tinggi persentase kesalahannya (lihat Gambar 2 dan Grafik 1). Misalnya, 3 koloni per cawan dari pengenceran 10^-1 menghasilkan perkiraan 30 CFU/mL dengan perkiraan eror 58 %. Oleh karena itu, harus ditentukan suatu batas bawah perhitungan (LOQ) untuk mencegah kesalahan yang lebih besar dalam perhitungan.

Gambar 2. Ilustrasi kerapatan koloni dari setiap tingkat pengenceran. Jumlah koloni yang baik berada pada cawan yang diarsir. Diambil dari dokumentasi pribadi.

Grafik 1. Eror akan semakin meningkat jika jumlah koloni yang dihitung semakin sedikit. Diadaptasi dari “USP30-NF25 1227 Validation of Microbial Recovery from Pharmacopeial Articles”, oleh ISO, 2007, hal. 684.

Selain itu dapat pula tingkat kesalahan digambarkan dalam koefisien varian (CV) yang dijelaskan pada grafik berikut.

Grafik 2. Hubungan antara jumlah partikel dan tingkat kesalahan yang didapatkan. Dapat dilihat jika perhitungan dilakukan kurang dari sekitar 20 koloni tingkat kesalahan akan semakin meningkat yang digambarkan CV semakin tinggi. Diadaptasi dari “ISO/TR 13843:2001 Water Quality – Guidance on Validation of Microbiological Methods”, oleh ISO, 2001, hal.15.

LOQ adalah suatu batas terendah jumlah koloni yang cukup/pantas untuk dapat dihitung dengan tingkat presisi dan akurasi yang dapat diterima. LOQ menggambarkan batas yang memberikan kemungkinan minimal untuk salah memperkirakan jumlah sel yang sebenarnya dalam suatu sampel. ISO (2003) dalam dokumen ISO 16140 mendefinisikan LOQ sebagai jumlah terkecil analit (jumlah aktual terkecil organisme) yang dapat diukur dan dihitung dengan presisi dan akurasi yang terdefinisi dibawah kondisi eksperimen metode dalam validasi metode tersebut (hal. 23).

Menurut ISO 13483 (2001) batas bawah kisaran hitung pada cawan harus dipilih pada angka disekitar 20 koloni. Namun metode baku lain juga memiliki LOQ masing-masing yang umumnya terletak antara 10-30 koloni/cawan (hal. 20). Sedangkan USP 1223 (2007) memberikan syarat kepresisian jumlah koloni yang dapat diterima pada kisaran RSD (relative standard deviation) sebesar 15-35 % yang dapat digambarkan pada tabel berikut (hal. 677).

Tabel 1. Gambaran RSD pada kisaran hitung plate count. Semakin kecil jumlah koloni per cawan maka semakin besar nilai RSD. Diadaptasi dari “USP30-NF25 1223 Validation of Alternatives Microbiological Methods”, oleh USP, 2007, hal. 677.

CFU/cawan	RSD
30-300	<15 %
10-30	<25 %
<10	<35 %

Jika didapat jumlah koloni kurang dari LOQ maka:

• Kesalahan statistik tinggi karena menurunnya keacakan distribusi sel saat pengambilan sampel (digambarkan oleh meningkatnya nilai eror atau koefisien varian secara drastis).
• Sangat sensitif terhadap kontaminan. Jumlah bakteri kontaminan yang tidak sengaja masuk memberikan pengaruh yang besar terhadap jumlah akhir koloni per cawan.
• Membutuhkan kerja aseptik yang lebih teliti.
• Jika jumlah koloni >LOD dan <LOQ maka densitas sel sebenarnya mungkin dapat terhitung dengan baik tapi masih sangat besar peluangnya untuk salah menghitung jumlah sel yang sebenarnya. Jumlah koloni yang baik seharusnya >LOQ dan >LOD.

3. Upper limit / Batas atas

Dalam ISO 13843 (2001) menyebutkan bahwa setiap metode memiliki suatu batas atas yang dapat dipercaya. Batasan tersebut tidak memiliki angka yang jelas tetapi hanya daerah samar-samar yang menyebabkan ketidakpastian yang tinggi pada perhitungan per cawannya (hal. 24). Upper limit dideskripsikan sebagai batas jumlah koloni paling banyak yang diizinkan setiap cawan untuk menghasilkan perhitungan yang dapat dipercaya. Hal ini disebabkan oleh terlalu banyaknya koloni sehingga menimbulkan keadaan jenuh dan tersumbat terutama untuk perhitungan koloni umum atau koloni target. Hitungan akan menjadi tidak valid jika lebih dari sepertiga luasan cawan dilingkupi oleh pertumbuhan koloni.

Batas atas dipengaruhi oleh ukuran koloni dan luasan permukaan hitung. Selain itu batas atas ditentukan juga oleh jumlah koloni non target yang tumbuh melingkupi koloni yang diinginkan karena kondisi ini dapat mempengaruhi perhitungan koloni target. Hal ini dapat digambarkan pada selektivitas nyata metodenya (apparent selectivity). ISO 13843 (2001) mendefinisikan Apparent selectivity sebagai rasio jumlah koloni target dengan jumlah koloni total pada volume sampel yang sama. Semakin selektif maka upper limit akan semakin besar. Selektivitas umumnya baik jika bernilai lebih dari -1 dan jika bernilai kurang dari -2, maka hasil yang didapatkan menjadi tidak valid (hal. 22). Hubungan antara selektivitas dengan upper limit dapat dilihat pada Tabel 2.

Tabel 2. Tabel hubungan antara nilai selektivitas dengan upper limit. Diadaptasi dari “ISO 13843:2001 Water Quality – Guidance on Validation of Microbiological Methods”, oleh ISO, 2001, hal. 22.

Selektivitas	Upper limit (koloni target/cawan)
0	500 (kultur murni)
-0,5 sampai -1	200 sampai 100
-1 sampai -2	100 sampai 25
dibawah -2	(P/A) Hanya deteksi

Jika didapat jumlah koloni lebih besar dari batas atas maka :

• Dimungkinkan ada sifat antagonisme antar spesies, misalnya bakteri A menghambat bakteri B dengan mengeluarkan metabolit tertentu (misalnya antibiotik) sehingga bakteri B tidak tumbuh karena keduanya berada pada posisi yang berdekatan. Semakin banyak koloni yang tumbuh pada permukaan agar, maka antar koloni dapat saling mempengaruhi baik menekan atau menstimulus pertumbuhan koloni tetangganya.
• Perebutan nutrisi/ kompetisi semakin ketat sehingga menimbulkan terbatasnya pertumbuhan.
• Kemungkinan dua koloni bergabung menjadi satu lebih besar sehingga mengaburkan jumlah sebenarnya karena menyangkut persyaratan pemilihan koloni yang dihitung sebagai 1 koloni.
• Memperbesar kemungkinan kesalahan (human error) dalam menghitung koloni yang dapat dimungkinkan karena kelelahan mata atau sebab lain.

Beberapa faktor diatas menjadi penyebab banyak koloni yang “hilang” sehingga menampakkan pengurangan koloni yang muncul pada cawan. Istilah untuk menggambarkan jumlah koloni yang melebihi batas atas kisaran hitung adalah TNTC (Too Numerous to Count). Penjelasan mengenai alasan adanya batas atas kisaran hitung dapat diperhatikan pada Gambar 3 dan Grafik 3 berikut.

Gambar 3. Ilustrasi terlalu penuhnya cawan saat mendekati batas atas sehingga tidak meningkatnya jumlah koloni yang teramati sesuai jumlah sebenarnya. Diadaptasi dari “Counting Colonies”,oleh Sutton, 2006, hal. 3.

Grafik 3. Hubungan antara tingkat pengenceran dan konsentrasi koloni. Dapat dilihat jika perhitungan dilakukan lebih dari batas atas maka tingkat kesalahan akan semakin meningkat yang digambarkan tidak liniernya grafik jumlah koloni yang teramati. Diadaptasi dari “Counting Colonies”oleh Sutton, S, 2006, hal. 3.

Gambar 4. Bagan yang perlu diperhatikan saat menghitung koloni. Setiap metode tertentu mensyaratkan supaya dipilih koloni didalam kisaran hitung (daerah yang diarsir). Saat menemui jumlah koloni diluar kisaran umumnya diatur dengan persyaratan khusus dan hasil diberi catatan estimated atau perkiraan. Diambil dari dokumentasi pribadi.

Indra Pradhika, 2018.

Referensi

EA-4/10 G:2002 Accreditation in Microbiological Laboratories, European Co-operation for Accreditation. (2002). Diperoleh dari: http://www.european-accreditation.org/publication/ea-4-10-g

Environtmental Protection Agency. (2009). Method Validation of U.S. Environtmental Protection Agency Microbiological Method of Analysis. Diperoleh dari: https://www.epa.gov/sites/production/files/2015-01/documents/final_microbiology_method_guidance_110409.pdf

ISO/TR 13843:2001. Water quality – Guidance on validation of microbiological methods. (2001).

ISO 8199: 2005 Water quality — General guidelines on the enumeration of microorganisms by culture. (2005).

Sutton, S. (2006). Counting Colonies. Pharmaceutical Microbiology Forum Newsletter. 12(9). Diperoleh dari http://www.microbiol.org/white.papers/WP.count.colony.htm.

USP30-NF25 1223 Validation of Alternatives Microbiological Methods. (2007). United States Pharmacopeial.

USP30-NF25 1227 Validation of Microbial Recovery from Pharmacopeial Articles. (2007). United States Pharmacopeial.