Persyaratan perhitungan dan pelaporan diperlukan untuk menseragamkan proses perhitungan dengan batasan tertentu supaya angka yang dilaporkan lebih dapat dipercaya. Beberapa faktor yang mempengaruhi perubahan syarat-syarat perhitungan dan pelaporan hasil adalah:

• Luas permukaan yang dilingkupi untuk pertumbuhan. Semakin luas maka dapat menurunkan batas pendeteksian (metode menjadi lebih peka);
• Jumlah inokulum (sampel) yang diinokulasikan. Semakin besar juga dapat menurunkan batas pendeteksian;
• Jenis mikroorganisme (spesifik atau umum) yang diperkirakan tumbuh. Jenis mikroorganisme target menentukan diameter koloni yang dihitung.

Berbagai ketentuan yang akan dibahas dibawah ini mengacu kepada syarat-syarat perhitungan dan pelaporan hasil jumlah koloni dari standar internasional dengan matriks sampel tertentu. Persyaratan detail dapat ditemui pada acuan dari FDA BAM, ISO dan APHA. Sedangkan AOAC tidak banyak menyebutkan persyaratan ini. Umumnya peraturan ini bersandar dengan penginokulasian pada cawan berdiameter 90 mm (diameter cawan yang umum ditemui). Kesesuaian metode standar dengan matriks sampel tertentu umumnya berbeda pada pemilihan jenis media. Sedangkan peraturan perhitungan koloni pada cawan prinsipnya adalah sama sehingga dapat mengacu kepada berbagai metode standar untuk memberikan gambaran umum yang lebih lengkap. Namun saat diberikan pilihan untuk memilih metode sesuai jenis sampel maka sebaiknya memilih metode baku tertentu yang cocok sesuai ruang lingkupnya.

1. Pengertian satuan CFU

Pemahaman tentang satuan dalam menghitung sel mikroba khususnya bakteri adalah sangat penting. Pada hasil akhir penghitungan bakteri pada cawan digunakan satuan CFU’s/volume atau berat. CFU’s adalah singkatan dari Colony Forming Unit’s yang artinya unit-unit / satuan pembentuk koloni (dalam tulisan selanjutnya ditulisakan CFU). CFU dapat disebut juga CFP yaitu singkatan Colony Forming Partilce. Satuan pembentuk koloni adalah sel tunggal atau sekumpulan sel yang jika ditumbuhkan dalam cawan akan membentuk satu koloni tunggal. Pada dasarnya sel tersebar homogen pada sampel, tetapi tedapat jenis bakteri yang pembelahan selnya dapat terpisah baik sehingga tersebar merata setiap sel dan ada pula bakteri yang setelah membelah, sel anakan masih menempel pada induknya (seperti halnya yang terjadi pada streptococcus, diplococcus, atau sarcina) sehingga penyebarannya berkelompok-kelompok. Pada jenis sel seperti ini jika tersebar merata dalam sekelompok sel maka pertumbuhannya tetap menjadi koloni tunggal yang bukan berasal dari satu sel saja melainkan dari beberapa sel. Oleh karena itu, jika satuan CFU menggambarkan jumlah sel atau “sel” maka tidak sepenuhnya salah karena pernyataan ini bertujuan untuk memudahkan imajinasi satuan ini meskipun tidak tepat.

ISO 13843 (2001) memberikan keterangan bahwa istilah CFU atau CFP pada mulanya diperkenalkan untuk menyatakan ide bahwa satu koloni mungkin berasal tidak hanya dari satu sel tetapi dari rangkaian atau sekumpulan sel, kelompok spora, atau sebatang miselium. Istilah ini tidak tepat untuk menyetarakan jumlah koloni yang diamati dengan jumlah sel yang hidup yang ditanam di media pertumbuhan. Growth units (satuan tumbuh), viable particle (partikel yang dapat hidup), propagule (suatu kesatuan yang dapat hidup, sel vegetatif, kelompok sel, spora, kelompok spora atau bagian miselium yang mampu berkembang dalam media pertumbuhan), dan germ (kesatuan hidup yang mampu untuk menghasilkan pertumbuhan dalam media pertumbuhan) adalah istilah yang artinya sama dan dipakai juga untuk metode MPN dan P/A (Presence/Absence) (hal. 2). Ilustrasi berbagai macam bentuk sel yang berada pada suatu volume tertentu dapat dilihat pada gambar 1.

Gambar 1. Ilustrasi sel dalam suatu volume tertentu. Setiap sel atau kumpulan sel yang terpisah bebas dalam suspensi akan tumbuh menjadi satu koloni. Diambil dari dokumentasi pribadi.

2. Penentuan koloni yang dihitung

Berikut persyaratan pemilihan koloni untuk dimasukkan sebagai satu koloni :

• Hitung sebagai satu koloni individual untuk koloni berpenampakan sama yang terpisah baik tanpa bertindihan dan minimal memiliki jarak antar koloni sebesar diameter koloni terkecilnya;
• Hitung masing-masing sebagai satu koloni individu untuk koloni yang bertindihan atau bersinggungan untuk dua koloni yang berbeda penampakannya (morfologi, warna, bentuk dll) (APHA, AWWA, & WEF SM 9215, 2004, hal. 3);
• Sedangkan FDA BAM Ch.3 (2001) dan ISO 7218 (2007) menambahkan persyaratan : Hitung masing-masing sebagai satu koloni individu untuk beberapa koloni yang bergabung menjadi satu (seperti bentuk rantai) tetapi masih dapat dibedakan koloni penyusunnya. Namun jika gabungan koloni yang saling bertindihan tersebut tidak dapat dibedakan dengan jelas maka hitung sebagai satu koloni (hal. 38);
• Hitung sebagai satu koloni untuk satu koloni spreader (menyebar) yang (1) berbentuk rantai yang tidak dapat dibedakan jelas karena disebabkan pecahnya kelompok sel (2) tumbuh antara agar dan bagian bawah cawan dan (3) tumbuh pada lapisan tipis air pada pinggir atau permukaan agar (FDA BAM Ch.3, 2001; APHA, AWWA, & WEF SM 9215, 2004, hal. 3). Pemilihan ini berlaku pada kondisi tertentu jika diperlukan, misalnya spreader yang tumbuh pada cawan yang memiliki jumlah koloni sedikit. Persyaratan pelaporan lebih rinci untuk dimasukkan perhitungan dapat ditemui di syarat pelaporan koloni spreader.

Gambar 2. Penampakan koloni pada cawan. Berdasarkan persyaratan pemilihan koloni maka kumpulan koloni diatas dihitung sebanyak 16 koloni termasuk koloni berukuran pin point. Diambil dari dokumentasi pribadi.

3. Rumus umum

Rumus umum untuk mengitung mikroorganisme dalam satuan CFU/mL (g) adalah sebagai berikut:

CFU/mL (g) = jumlah koloni/jumlah sampel yang diinokulasikan (ditanam)

(APHA, AWWA, & WEF SM 9215, 2004, hal. 2)

Misalnya : cawan menghasilkan 50 koloni dari tingkat pengenceran 1/100 dengan jumlah sampel yang diinokulasikan 0,1 mL (spread plate).

CFU/mL = 50 CFU / (0,1· (1/100)) mL

= 50 CFU / 0,001 mL

= 50.000 CFU / mL

4. Pelaporan dalam kisaran hitung

Terdapat beberapa pilihan kisaran hitung untuk plate count secara umum. FDA BAM Ch.3 (2001) menyarankan untuk memakai kisaran 25-250 koloni/cawan untuk pour plate (bag. C), AOAC OM 996.23 memberi pilihan kisaran 30-300 koloni/cawan. Sedangkan ISO 7218 (2007, hal. 38) dan ISO 8199 (2005, hal.10) memberikan kisaran 10-200 untuk spread plate, 10-300 koloni/cawan untuk pour plate dan untuk koloni tipikal (presumptive) yang digunakan pada media selektif adalah 10-150 koloni/cawan. APHA, AWWA, & WEF SM 9215 (2004) menentukan 30-300 koloni/cawan untuk pour plate dan spread plate (hal. 2). Namun semua persyaratan ini tidak baku untuk koloni tipikal (koloni mikroorganisme target) pada media selektif karena harus disesuaikan dengan standar yang diacu dan jenis mikroorganisme target, misalnya diperlukan kisaran tersendiri untuk perhitungan Yeast and Mold. Seseorang dapat memilih kisaran hitung yang cocok sesuai metode yang diacu. Ringkasan berbagai kisaran hitung sesuai spesifikasi dan tujuannya dapat dilihat pada tabel berikut.

Tabel 1. Perbandingan berbagai kisaran hitung koloni/cawan dengan jenis uji dan teknik inokulasi yang berbeda dari berbagai macam metode standar. Diolah dari sumber metode yang disebutkan pada tabel.

Jenis uji	Teknik	Koloni/ cawan	Acuan metode	Cakupan
APC	pp	25-250	FDA BAM Ch.3 (2001)	Pg.
APC	pp/sp	30-300	APHA AWWA WEF 9125 (2004, hal. 2)	Air
APC	pp	30-300	AOAC OM 996.23 (2005: Ch17,hal. 4)	Pg.
APC; umum	pp/sp	10-300	ISO 7218 (2007, hal. 38)	Pg. & Pk.
APC; umum	sp	10-200	ISO 8199 (2005, hal. 10)	Air
APC; umum	pp	10-300	ISO 8199 (2005, hal.10)	Air
APC	pp	30-300	USP 2021 (2007, hal. 268)	Pg. (farmasi)
APC	sp	20-200	ASTM D5465 (1998, hal. 11)	Air
APC	pp	30-300	ASTM D5465 (1998, hal. 11)	Air
Koloni tipikal; umum	pp/sp	10-150	ISO 8199 (2005, hal. 10)	Air
Coliform	pp	10-300	ISO 4832 (2006, hal. 5)	Pg. & Pk.
Yeast and Mold	pp/sp	10-150	ISO 7218 (2007, hal. 44)	Pg. & Pk.
Yeast and Mold	sp	<150	ISO 21527-2 (2008, hal. 6)	Pg. & Pk.
Yeast and Mold	sp	<150	APHA, AWWA, & WEF SM 9610 C (2000)	Air
Yeast and Mold	sp	10-150	FDA BAM Ch.18 (2001)	Pg.
Enterobacteriaceae	pp	<150	ISO 21528 (2004, hal. 6)	Pg. & Pk.
S.aureus	pp	15-150	ISO 6888-1 (1999, hal. 6)	Pg. & Pk.
S.aureus	sp	20-200	AOAC OM 975.55 (2005: Ch17,hal. 90)	Pg.
S.aureus	sp	20-200	FDA BAM Ch.12 (2001)	Pg.
Bacillus cereus	sp	15-150	FDA BAM Ch.14 (2001)	Pg.
Clostridium perfringens	sp	20-200	FDA BAM Ch.16 (2001)	Pg.
catatan : pp : pour plate; sp : spread plate; Pg. : pangan; Pk. : pakan.

Terdapat beberapa cara baku menghitung koloni yang masuk dalam kisaran hitung, salah satunya adalah berdasarkan FDA BAM Ch.3 (2001) berikut.

Cawan yang memiliki koloni sesuai kisaran hitung (cawan yang tidak masuk kisaran hitung tidak dihitung) dihitung dengan rumus:

N = (∑C) / ((1·n₁)+(0,1·n₂)·(d) …(Rumus 1)

∑C : jumlah semua koloni pada semua cawan

N : jumlah mikroorganisme CFU/g (mL).

n₁ : jumlah cawan pada pengenceran pertama

n₂ : jumlah cawan pada pengenceran kedua / berikutnya;

d : pengenceran dimana hitungan pertama (dari pengenceran pertama) diperoleh (bag. D).

Contoh :

Gambar 3. Contoh hasil uji APC pada media PCA. Penanaman dilakukan dengan pengulangan dua kali (duplo) setiap pengenceran dari tiga tingkat pengenceran (jumlah koloni tidak sesuai dengan contoh perhitungan). Diambil dari dokumentasi pribadi.

1/10	1/100	1/1000
TNTC (>250)	232 (25-250)	33 (25-250)
TNTC (>250)	244 (25-250)	23 (<25)

Perhitungan :

n₁ : 2 cawan

n₂ : 1 cawan (23 tidak masuk kisaran)

d : 1/100

N = (∑C) / ((1· n₁) + (0,1·n₂) · (d))

N = ((232+244+33) / ((1 . 2) + (0,1. 1) . (1/100)) CFU/g

N = (509 / 0,021) CFU/g

N = 24.238,09 CFU/g

N = 24.000 CFU/g

Pada contoh digunakan pour plate. Jika digunakan spread plate maka harus dikali 10 karena memiliki satuan CFU/0,1 g.

ISO 7218 (2007) memberikan rumus umum berikut untuk menghitung koloni yang masuk kisaran hitung:

N = ∑C / V·1,1·d…(Rumus 2)

∑C : jumlah semua koloni pada dua cawan dari dua pengeceran berurutan

N : jumlah mikroorganisme CFU /g (mL).

V: jumlah volume inokulum yang dimasukkan ke dalam setiap cawan (mL)

d : pengenceran dimana hitungan pertama (dari pengenceran pertama) diperoleh (hal. 38).

Pada prinsipnya N = ∑C / V·1,1·d…(Rumus 2) adalah sama dengan N = (∑C) / ((1·n₁)+(0,1·n₂)·(d) …(Rumus 1), tetapi rumus ini hanya dapat digunakan pada penanaman satu cawan dari dua pengenceran yang berurutan. Jika dipakai untuk mengitung contoh kasus diatas maka hasil yang didapat akan tidak sama.

Contoh:

d : 1/100

V : 1 mL (pour plate)

N = ∑C / V·1,1·d

N = (232+244+33) / 1·1,1·(1/100)

N = 509 / 0,011

N = 46272,723 CFU/g

N = 46.000 CFU/g

Hasil yang diperoleh tidak sama karena rumus ini menganggap bahwa dua cawan dari dua pengenceran pasti memiliki koloni yang masuk dalam kisaran (angka pembagi 1,1) sehingga lebih tidak fleksibel untuk penanaman duplo.

Sedangkan menurut ISO 8199 (2005), perhitungan koloni yang masuk kisaran dihitung dengan rumus:

C_s = (Z / V_tot)·V_s…(Rumus 3)

C_s: perkiraan jumlah CFU pada volume acuan V_s dari sampel;

Z : jumlah total koloni yang dihitung pada cawan yang diambil dari pengenceran d₁, d₂, ….. d_i;

V_s :volume acuan yang dipilih untuk menunjukkan konsentrasi mikroorganisme pada sampel;

V_tot: volume total yang dihitung dari sampel mula-mula termasuk yang ada di dalam cawan yang dihitung. V_tot juga merupakan jumlah volume yang terpisah dari setiap porsi uji yang dapat dirumuskan dengan:

V_tot = ( n₁·V₁·d₁) + (n₂·V₂·d₂) + …… (n_i·V_i·d_i)…(Rumus 4)

n₁,n₂,…. n_i : jumlah cawan yang digunakan dari pengenceran d₁,d₂,….d_i;

V₁,V₂,….V_i : volume yang digunakan disertai pengencerannya;

d₁,d₂,….d_i : pengenceran yang digunakan untuk volume uji (d = 1 untuk sampel tanpa pengenceran, d = 0,1 untuk sampel yang diencerkan 1/10) (hal. 10).

Contoh (dipakai kisaran 25-250):

1/10	1/100 (d1)	1/1000 (d2)
TNTC (>250)	232 (25-250)	33 (25-250)
TNTC (>250)	244 (25-250)	23 (<25)

Perhitungan :

n₁ : 2 cawan

n₂ : 1 cawan (23 tidak masuk kisaran)

V₁ : 1

V₂ : 1

d₁ : 0,01 (1/100)

d₂ : 0,001 (1/1000)

Z = x₁ + x₂ + x₃

Z = 232 + 244 + 33 = 509

Jika memakai V_s = 1 ml (pour plate) = 1 g

V_tot = ( n₁·V₁·d₁) + (n₂·V₂·d₂) + …… (n_i·V_i·d_i)

V_tot = (2·1·0,01) + (1·1·0,001) = 0,021

C_s = (Z / V_tot) ·V_s

C_s = (509/0,021) · 1

C_s = 24.238,09 CFU/g

C_s = 24.000 CFU/g

Jadi rumus 1 dan 3 menghasilkan perhitungan akhir yang sama.

Menurut ISO 8199 (2005) jika digunakan untuk menghitung koloni tipikal pada media selektif dan metode tersebut mensyaratkan untuk dilakukan uji konfirmasi dari koloni tipikal tersebut maka ditambah rumus:

x = (k/n) · z…(Rumus 5)

x : perkiraan jumlah koloni terkonfirmasi (tipikal) per cawan (Z);

k: jumlah koloni yang sesuai dengan kriteria konfirmasi diantara koloni yang diinokulasikan sebanyak n koloni;

n : jumlah koloni presumptive / dugaan positif yang diinokulasikan dari cawan untuk konfirmasi;

z : jumlah total koloni presumptive yang dihitung pada cawan.

Catatan :

jangan membulatkan hasil uji konfirmasi intermediet x. Hitung jumlah (Cs) mikroorganisme yang terkonfirmasi atau teridentifikasi pada sampel dengan mengganti Z dengan X (jumlah dari x) (hal. 10).

Contoh :

Misalnya (kasus berbeda dengan contoh sebelumnya) pada uji S. aureus menggunakan media selektif Baird Parker agar yang menghasilkan koloni tipikal dan atipikal. Pada cawan yang menghasilkan 244 koloni (total koloni tipikal dan atipikal) mengandung 66 koloni tipikal S. aureus. Dari 66 koloni tipikal (terduga) tersebut dikonfirmasi sebanyak 8 koloni menggunakan uji koagulase. 6 koloni menghasilkan uji positif dan sisanya menghasilkan uji negatif. Jumlah koloni terkonfirmasi seluruhnya adalah :

z : 66 koloni

n : 8 koloni (yang diuji)

k : 6 koloni (yang positif)

x₁ = (k/n) · z

x₁ = (6/8) · 66 koloni

x₁ = 49,5 koloni (tidak dibulatkan)

Cawan lain yang memenuhi kisaran juga dihitung dengan cara yang sama (misalnya dipakai 15-150 koloni/cawan untuk S.aureus).

1/100 (d1)			1/1000 (d2)
Koloni total (tipikal +atipikal)	Koloni tipikal	Koloni terkonfirmasi	Koloni total (tipikal +atipikal)	Koloni tipikal	Koloni terkonfirmasi
244	66	k : 6 koloni n : 8 koloni x1 = (6/8)·66 x1 = 49,5 (15-150)	33	11	k : 4 koloni n : 5 koloni x3 = (5/5) ·11 x3 = 11 (<15)
232	80	k : 6 koloni n : 9 koloni x2 = (6/9)·80 x2 = 53,3 (15-150)	23	4	k : 4 koloni n : 4 koloni x4 = (4/4) ·4 x4 = 4 (<15)

Perhitungan :

X = x₁ + x₂ + x₃ + x₄

X = 49,5 + 53,3 = 102,8

Jika memakai V_s = 1 ml (pour plate) = 1 g

Z = X

V_tot = ( n₁·V₁·d₁) + (n₂·V₂·d₂) + …… (n_i·V_i·d_i)

V_tot = (2·1·0,01) + (0·1·0,001)

V_tot = 0,02

C_s = (Z / V_tot)·V_s

C_s = (102,8/0,02)·1

C_s = 5.140 CFU/g

C_s = 5.100 CFU/g (S. aureus)

ISO 8199 (2005) menyarankan sebaiknya semua koloni tipikal harus diuji untuk dikonfirmasi. Namun jika tidak memungkinkan maka jumlah minimal koloni tipikal yang harus diuji (n) adalah 5 koloni/cawan yang dipilih dari berbagai daerah bagian cawan. Sebaiknya uji semua koloni tipikal jika hanya terdapat 1-5 koloni (hal. 12).

5. Pelaporan <LOD

Jika tidak tedapat pertumbuhan koloni pada semua cawan maka menurut FDA BAM Ch.3 (2001) sebaiknya laporkan sebagai kurang dari 1 x pengenceran terendah yang digunakan kemudian perhitungan diberi catatan dengan asterik (tanda bintang “*”) yang menyatakan bahwa perhitungan tersebut adalah perkiraan atau EAPC (Estimated Aerobic Plate Count) karena berada diluar batas kisaran hitung (bag. D). Sedangkan ISO 7218 (2007) memberi peraturan untuk melaporkannya sebagai “kurang dari 1/d mikroorganisme/mL (g)”, dimana d adalah faktor pengenceran mula-mula dari pengencer petama yang diinokulasikan. d sama dengan 10⁰ dan sama dengan 1 jika sampel langsung ditanamkan atau diinokulasikan ke agar seperti pada jenis sampel cair (hal. 41). Tidak banyak berbeda dengan sebelumnya, ISO 8199 (2005, hal. 14) dan APHA, AWWA, & WEF SM 9215 (2004, hal. 2) melaporkannya sebagai “kurang dari 1/V_tot CFU (CFP) / mL. Dimana V_tot adalah volume total (volume terbesar) yang dihitung dari sampel mula-mula termasuk yang ada di dalam cawan yang dihitung. Jika diinginkan dapat juga dilaporkan sebagai “nol” atau “mikroorganisme tidak terdeteksi” kemudian di catat volume sampel yang dianalisis.

Perlu diketahui bahwa pernyataan kurang dari 1 (<1) menggambarkan ketidakpastian jumlah sel yang berada pada total sampel walaupun volume sampel inokulum menghasilkan nol koloni. Pelaporan sebagai 0 mutlak sebaiknya dihindari karena belum tentu produk steril sekalipun benar-benar terbebas dari mkroorganisme.

Contoh :

1/10	1/100	1/1000
0	0	0
0	0	0

Perhitungan :

N = <1 x 10

N = <10 CFU/g *

*EAPC

atau

C_s = <1 / (d)

C_s = <1 / (1/10)

C_s = <10 mikroorganisme / g

atau

C_s = <1 / V_tot

C_s = <1 / (1/10)

C_s = <10 CFU / g

6. Pelaporan <LOQ

Jika semua cawan dari semua pengenceran menghasilkan jumlah koloni dibawah LOQ (25) maka laporkan dengan <25 x 1/d, dimana d adalah faktor pengenceran dari hitungan yang diambil dan diberi tanda (*) yang menyatakan bahwa angka tersebut adalah perkiraan EAPC (Estimated Aerobic Plate Count) (FDA BAM Ch.3, 2001, bag. D).

Contoh :

1/10	1/100	1/1000
23 (<25)	4 (<25)	0 (<25)
20 (<25)	2 (<25)	0 (<25)

Perhitungan :

N = <25·1/(1/10)

N = <25·10

N = <250 CFU/g*

*EAPC

Berbeda dengan FDA, ISO membagi lagi perhitungan dibawah LOQ ke dalam dua bagian kisaran. ISO 7218 (2007) mensyaratkan jika cawan mengandung kurang dari 10 koloni (LOQ dari acuan tersebut) tetapi paling tidak ada 4 koloni maka dihitung dengan rumus umum dan dilaporkan dengan jumlah perkiraan x / mL (g). Namun jika jumlah total berada diantara 1 sampai 3, presisi hasil menjadi sangat rendah dan dilaporkan sebagai ”terdapat mikroorganisme tetapi kurang dari (4 x d) / g(mL)” (hal. 40). Pada kasus ini (1-3 koloni) ISO 8199 (2005) memberikan aturan pelaporan dengan “terdapat organisme pada volume yang diuji” (hal.13).

Contoh :

1/10	1/100	1/1000
8 (<10)	0 (<10)	0 (<10)
6 (<10)	0 (<10)	0 (<10)

Dihitung dengan rumus umum :

n₁ : 2 cawan

V₁ : 1

d₁ : 0,1 (1/10)

Z = x₁ + x₂

Z = 8 + 6 = 14

Jika memakai V_s = 1 mL (pour plate) = 1 g

V_tot = ( n₁·V₁·d₁) + (n₂·V₂·d₂) + …… (n_i·V_i·d_i)

V_tot = (2·1·0,1) = 0,2

C_s = (Z / V_tot) ·V_s

C_s = (14/0,2) ·1

C_s = 70 CFU/g (estimated number)

1/10	1/100	1/1000
1 (<10)	0 (<10)	0 (<10)
2 (<10)	0 (<10)	0 (<10)

Perhitungan :

C_s = <4·1/(1/10)

C_s = <4·10

C_s = <40 CFU/g

terdapat mikroorganisme tetapi kurang dari 40 CFU/g

atau

terdapat organisme pada volume yang diuji

7. Pelaporan >Upper limit

FDA BAM Ch.3 (2001) mensyaratkan jika semua cawan dari semua pengenceran menghasilkan jumlah koloni diatas upper limit (250) dan kurang dari 100 CFU/cm² maka laporkan dengan mengambil cawan yang paling mendekati 250 dan diberi tanda (*) yang menyatakan bahwa angka tersebut adalah perkiraan EAPC (Estimated Aerobic Plate Count). Namun jika semua cawan dari semua pengenceran menghasilkan koloni rata-rata >100 CFU/cm² maka laporkan sebagai >100 x luas area cawan x pengenceran tertinggi (bag. D).

Contoh :

1/10	1/100	1/1000
TNTC (>250)	TNTC (>250)	425 (>250)
TNTC (>250)	TNTC (>250)	450 (>250)

Perhitungan :

n₁ : 2 cawan

d : 1/1000

N = (∑C) / ((1·n₁) + (0,1· n₂) · (d))

N = ((425 + 450) / ((1·2) + (0,1·0) · (1/1000)) CFU/g

N = (875 / 0,002) CFU/g

N = 43.750 CFU/g

N = 44.000 CFU/g*

*EAPC

1/10	1/100	1/1000
TNTC (>250)	TNTC (>250)	7150 (>250)
TNTC (>250)	TNTC (>250)	7150 (>250)

Perhitungan :

Misalnya didapatkan rata-rata dari n transek ulangan yang representatif adalah 110 CFU/cm² dan memakai cawan dengan luas 65 cm².

A = π·r²

A = 65 cm²

C = 110 · A

C = 110 · 65

C = 7150 koloni/cawan

Pelaporan :

N = >100·A·1/d

N = >100·(65)·1/(1/1000)

N = >6.500.000 CFU/g*

*EAPC

Catatan : jika digunakan cawan dengan luas 65 cm² maka batasannya adalah 6500 koloni/cawan.

APHA, AWWA, & WEF SM 9215 (2004) memberikan aturan yang sedikit berbeda jika dijumpai semua cawan diatas upper limit. Jika jumlah koloni >300 (digunakan kisaran 30-300) jangan dilaporkan sebagai TNTC (Too Numerous To Count).

1. Jika jumlah koloni tersebut < 10 koloni/cm² maka hitung koloni pada 13 transek kotak (kotak 1×1 cm) yang merepresentasikan distribusi koloni untuk luas cawan 65 cm². Jika memungkinkan pilih 7 kotak berurutan secara horisontal dan 6 kotak vertikal pada cawan. jangan menghitung satu kotak lebih dari sekali. Kemudian hitung jumlah perkiraan koloni dengan cara :

(Jumlah total koloni pada 13 kotak) x 5 ; jika luas cawan 65 cm² (cawan gelas)

(Jumlah total koloni pada 19 kotak) x 3 ; jika luas cawan 57 cm² (cawan plastik)

2. Jika jumlah koloni >100 koloni/cm² maka laporkan sebagai

>6500 / jumlah volume sampel terkecil yang ditanam

>5700 / jumlah volume sampel terkecil yang ditanam

Laporkan sebagai perkiraan (estimated) (hal. 3).

Contoh :

1/10
Transek : 1:8 2: 8 3: 9 4: 8 5: 9 6: 6 7: 9 8: 7 9: 5 10: 9 11: 6 12: 6 13: 7	Transek : 1:8 2: 6 3: 9 4: 8 5: 6 6: 5 7: 8 8: 7 9: 4 10: 5 11: 6 12: 6 13: 9

Perhitungan :

n₁ : 2 cawan

n₂ : 0 cawan

jumlah total pada cawan n_1a : 97×5 = 485 koloni

jumlah total pada cawan n_1b : 87×5 = 435 koloni

C_s = ((485+435)/2)×10 CFU/mL

C_s = 460×10 CFU/mL

C_s = 4600 CFU/mL

ISO 7218 (2007) menyuguhkan peraturan detail untuk perhitungan diatas upper limit dengan memperhatikan jumlah koloni pada pengenceran selanjutnya yang <LOQ. Batas pada peraturan ini menggunakan 10-300 koloni/cawan dan dapat diganti dengan angka yang sesuai dengan metode standard spesifik yang diacu.

Jika jumlah koloni pada pengenceran pertama (d₁) >300 dan jika pada pengenceran kedua (d₂) menghasilkan <10 koloni;

Jika jumlah koloni pada pengencera pertama (d₁) berada pada interval 300–334, maka hitung menggunakan rumus umum.

Jika jumlah koloni pada pengencera pertama (d₁) >334, maka perhitungan hanya mengambil dari pengenceran kedua (d₂) dengan perhitungan perkiraan (estimated), kecuali jika jumlah maksimum 300 telah diatur untuk perhitungan jumlah koloni dan jumlah koloni pada d₂ <8 maka nilai antar dua pengenceran tidak dapat diterima (hal. 41-43).

Contoh 1 :

1/100 (d1)	1/1000 (d2)
325 (300-334)	8 (<10)

Pelaporan : dihitung menggunakan rumus umum

n₁ : 1 cawan

n₂ : 1 cawan

V₁ : 1

V₂ : 1

d₁ : 0,01 (1/100)

d₂ : 0,001 (1/1000)

Z = x₁ + x₂ + x₃

Z = 325 + 8 = 331

Jika memakai V_s = 1 mL (pour plate) = 1 g

V_tot = ( n₁·V₁·d₁) + (n₂·V₂·d₂) + …… (n_i·V_i·d_i)

V_tot = (1·1·0,01) + (1·1·0,001) = 0,011

C_s = (Z/V_tot) ·V_s

C_s = (333/0,011)·1

C_s = 30·272,72 CFU/g

C_s = 30.000 CFU/g

Contoh 2.a :

1/100 (d1)	1/1000 (d2)
355 (>334)	9 (<10)

Pelaporan : jumlah koloni diambil dari d₂

n₂ : 1 cawan

V₂ : 1

d₂ : 0,001 (1/1000)

Z = x₁ + x₂ + x₃

Z = 8

Jika memakai V_s = 1 mL (pour plate) = 1 g

V_tot = ( n₁·V₁·d₁) + (n₂·V₂·d₂) + …… (n_i·V_i·d_i)

V_tot = (1·1·0,001) = 0,001

C_s = (Z / V_tot) ·V_s

C_s = (9/0,001)·1

C_s = 9.000 CFU/g (estimated)

Contoh 2.b: Jika maksimum 300 sudah diatur untuk perhitungan koloni dan d₂ <8

1/100 (d1)	1/1000 (d2)
355 (>334)	6 (<10), (<8)

Pelaporan :

Jumlah koloni antar dua pengenceran tidak dapat diterima.

Jika jumlah koloni pada setiap cawan di semua pengenceran >300, maka laporkan sebagai :

“lebih dari 300/d mikroorganisme (CFU) / g(mL)” untuk total atau tipikal koloni

atau

“lebih dari 300 x k/n x 1/d mikroorganisme (CFU) / g(mL)” untuk koloni terkonfirmasi

Contoh :

1/100 (d1)	1/1000 (d2)
TNTC (>300)	456 (>300)

Pelaporan :

C_s = >300/ (1/1000)

C_s = >300.000 CFU/g

1/100 (d1)			1/1000 (d2)
Koloni total (tipikal +atipikal)	Koloni tipikal	Koloni terkonfirmasi	Koloni total (tipikal +atipikal)	Koloni tipikal	Koloni terkonfirmasi
TNTC	TNTC		TNTC	TNTC	k : 5 koloni n : 6 koloni x1= >300.(5/6) x1 = >250

Pelaporan :

C_s = >300·( k/n)·1/ (1/1000)

C_s = >300·(5/6)·1/ (1/1000)

C_s = >250.000 CFU/g

ISO 7218 (2007, hal. 41-43) dan ISO 8199 (2005, hal. 14-15) juga memberikan petunjuk yang rinci untuk perhitungan diatas upper limit untuk koloni tipikal yang membutuhkan adanya uji konfirmasi. Peraturan pelaporan ini memperhatikan pengaruh antara jumlah koloni tipikal dan jumlah koloni total yang tercampur dalam satu cawan. Batas pada peraturan ini menggunakan 10-300 koloni/cawan dan dapat diganti dengan angka yang sesuai dengan metode standar spesifik yang diacu.

Jika jumlah koloni tipikal dan atipikal pada pengenceran pertama (d₁) >300 dengan koloni tipikal atau terkonfirmasi yang tampak dan jika pada pengenceran kedua (d₂) menghasilkan <300 koloni dengan tidak ada koloni tipikal yang tampak, maka laporkan sebagai :

“kurang dari 1/d₂ dan lebih dari 1/d₁ mikroorganisme (CFU) / mL (g)”.

Contoh :

1/100 (d1)			1/1000 (d2)
Koloni total (tipikal +atipikal)	Koloni tipikal	Koloni terkonfirmasi	Koloni total (tipikal +atipikal)	Koloni tipikal	Koloni terkonfirmasi
345	6	k : 6 koloni n : 6 koloni x1 = (6/6).6 x1 = 6	33	0

Pelaporan :

Cs = < 1000 dan >100 CFU/g

Jika jumlah koloni tipikal dan atipikal pada pengenceran pertama (d₁) >300 tanpa koloni tipikal atau terkonfirmasi yang tampak dan jika pada pengenceran kedua (d₂) menghasilkan <300 koloni dengan tidak ada koloni tipikal yang tampak, maka laporkan sebagai :

“kurang dari 1/d₂ mikroorganisme (CFU)/mL (g)”

Contoh :

1/100 (d1)			1/1000 (d2)
Koloni total (tipikal +atipikal)	Koloni tipikal	Koloni terkonfirmasi	Koloni total (tipikal +atipikal)	Koloni tipikal	Koloni terkonfirmasi
345	0		33	0

Pelaporan :

Cs = < 1000 CFU/g

8. Pelaporan koloni menyebar

Menurut BAM BAM, Ch.3 (2003) terdapat beberapa penyebab suatu koloni disebut koloni menyebar/spreader dan dibagi menjadi tiga tipe. Tipe pertama (1) adalah disebabkan disintegrasi sekelompok bakteri sehingga menyebabkan koloni berbentuk rantai yang tidak terlalu terpisah jauh. Tipe kedua (2) adalah karena tumbuhnya bakteri pada lapisan tipis air di tepian cawan atau permukaan agar. Sedangkan tipe ketiga (3) adalah tumbuhnya bakteri pada lapisan tipis air di antara agar dan bagian bawah cawan. Jika cawan memiliki koloni spreader yang sangat luas sehingga (a) luasan cawan yang terlingkupi koloni spreader termasuk total area yang tertekan pertumbuhannya melebihi 50% dari seluruh luas cawan, atau (b) luasan yang tertekan pertumbuhannya karena koloni spreader tersebut melampaui 25% seluruh luas cawan, maka laporkan sebagai spreader (SPR). Jika memang dibutuhkan untuk menghitung cawan berkoloni spreader yang tidak dihilangkan oleh persyaratan diatas (a dan b), maka hitung setiap 3 tipe koloni spreader (tipe 1, 2 dan 3) sebagai satu sumber koloni. Untuk koloni spreader dari tipe 1, jika hanya terdapat satu koloni berantai hitung sebagai satu koloni. Jika terdapat satu atau lebih dari satu koloni berantai yang menampakkan sumber koloni asli yang terpisah baik maka hitung setiap sumber sebagai satu koloni. Namun jangan menghitung setiap pertumbuhan individu koloni yang seperti rantai sebagai koloni tunggal. Umumnya tipe 2 dan 3 umumnya menghasilkan koloni yang berbeda (bag. C).

Sedangkan ISO 7218 (2007) memberikan peraturan bahwa jika ditemukan koloni spreader maka pertimbangkan koloni spreader sebagai koloni tunggal. Jika koloni spreader tumbuh kurang dari seperempat luas cawan maka luasan cawan yang tidak terlingkupi koloni spreader tetap dihitung untuk keseluruhan luas cawan dengan mengurangi koloni spreader dan mengekstrapolasikan jumlah teoretis yang akan didapatkan jika tanpa ada koloni spreader. Namun jika luas koloni spreader melebihi seperempat cawan maka cawan tidak perlu dihitung dan laporkan sebagai spreader (SPR) (hal. 38).

APHA, AWWA, & WEF SM 9215 (2004) menyuguhkan persyaratan yang sangat mirip untuk koloni spreader. Jika ditemukan koloni spreader maka hitung koloni (non-spreader) pada bagian yang mewakili. Hal ini dilakukan bila hanya koloni tersebut tersebar dengan baik di daerah yang tidak dilingkupi koloni spreader dan luas koloni spreader tidak melebihi seperempat luas total cawan. Namun jika koloni spreader terpaksa harus dihitung maka hitung koloni spreader sebagai satu koloni untuk setiap tipe koloni spreader. Tipe tersebut adalah (a) koloni berantai yang tampak karena disintegrasi sekelompok sel bakteri, (b) koloni spreader yang tumbuh pada agar dan bagian bawah cawan, (c) dan koloni spreader yang tumbuh pada lapisan tipis air di pinggir atau permukaan agar. Laporkan cawan yang memiliki koloni spreader yang sangat luas sebagai “spreaders“ (Spr) (hal. 3).

Terkadang cawan pada pengenceran rendah tampak menghasilkan koloni menyebar yang seringkali dilaporkan sebagai spreader. Namun sebenarnya koloni menyebar ini timbul karena terlalu banyak dan padatnya koloni pada cawan yang memungkinkan bersinggungan (overlap) setelah diinkubasi. Cawan seperti ini tetap mengikuti kaidah pelaporan diatas upper limit (TNTC) dan bukan dilaporkan sebagai SPR.

Gambar 4. Beberapa penampakan koloni spreader dan beserta persyaratannya. Diambil dari dokumentasi pribadi (diolah berdasarkan ISO 7218 hal. 38).

9. Pelaporan adanya kontaminasi dan kesalahan kerja

Kesalahan penanaman kadang terjadi sehingga menyebabkan hasil pertumbuhan meragukan atau perhitungan yang tidak masuk akal. APHA, AWWA, & WEF SM 9215 (2004) menyebutkan beberapa sebab kesalahan ini diantaranya adalah tidak bisa dihitung karena pengenceran yang terlewat, tetesan yang tidak sengaja, terduga kontaminasi atau cawan kontrol mengindikasikan telah terkontaminasi. Jika ditemukan cawan atau pengujian seperti sebab diatas maka dilaporkan sebagai “laboratory accident” (LA) (hal. 3). Begitu juga FDA BAM Ch. 3 (2001) memberikan aturan jika ditemui cawan yang tidak memuaskan atau terkontaminasi maka dilaporkan sebagai “laboratory accident” (LA) (bag. C).

Ciri-ciri koloni pengontaminan umumnya (tidak selalu) adalah (1) tumbuh pada pinggiran cawan berhimpit pada dinding cawan, (2) terdapat koloni pada cawan dari pengenceran tertentu dengan pengenceran sebelumnya menunjukkan tidak ada pertumbuhan, (3) jumlah koloni pada pengenceran tertentu tidak sesuai dengan kelipatan 1/10, atau sebab lainnya. Suatu laboratorium biasanya memiliki kecenderungan jenis pengontaminan tertentu akibat dari bocornya biakan dari kultur uji sebelumnya, seperti jenis Bacillus atau kapang.

10. Pembulatan angka

Semua metode standar memberikan aturan untuk melaporkan hanya dua angka penting (significant figure) yaitu dua digit dari kiri pembacaan saat melaporkan hasil perhitungan kemudian digit ketiga diganti dengan angka 0. Penulisan hanya dua angka penting ini bertujuan untuk mencegah timbulnya kesan pergeseran sehingga terjadi beda pendapat (frictious impression) dari perhitungan presisi dan akurasinya. Seperti halnya dalam menghitung ribuan semut secara matematis tidak akan dapat dilaporkan terdapat 12.345 semut karena bagaimanapun juga terdapat faktor ketidaktepatan perhitungan dan ketidakpastian lainnya.

Terdapat dua ‘cabang’ peraturan dalam pembulatan angka penting tersebut. Perbedaan ini terjadi saat ditemui angka 5 pada digit ke tiga. SM 9215 dan ISO 8199 mensyaratkan bulatkan ke atas untuk angka penting kedua jika angka pada digit ketiga adalah 5,6,7,8 atau 9 dan bulatkan ke bawah jika angka pada digit ketiga adalah 1,2,3 atau 4 (APHA, AWWA, & WEF SM 9215, 2004, hal. 3; ISO 8199, 2005, hal. 10). FDA BAM Ch.3 (2001) menggunakan cara yang sedikit berbeda yaitu bulatkan ke atas jika angka pada digit ketiga adalah 6, 7, 8 atau 9 dan bulatkan ke bawah jika angka pada digit ketiga adalah 1, 2, 3 atau 4. Namun jika angka pada digit ketiga adalah angka 5 maka bulatkan ke atas untuk digit kedua jika angka pada digit kedua adalah ganjil dan bulatkan ke bawah bila angka pada digit kedua adalah genap (bag. D).

Contoh :

sebelum	sesudah	sebelum	sesudah
12.750	13.000	12.750	13.000
12.460	12.000	12.460	12.000
15.567	16.000	15.567	16.000
14.598	15.000	14.598	14.000
185	190	185	180
175	180	175	180
35	35	35	35
34	34	34	34
SM 9215 dan ISO 8199		BAM Ch.3

11. Bentuk pelaporan angka

ISO 8199 (2005) menunjukkan cara ekspresi pelaporan angka hasil akhir perhitungan (setelah dibulatkan) dapat dituliskan dengan angka antara 1,0 sampai 9,9 dikalikan kelipatan eksponensial dari angka 10 (misal : 2,3 × 10³ CFU/g) atau juga dapat dituliskan seluruh angkanya dengan dua angka penting (misal: 23.000 CFU/g) (hal. 10).

Seringkali pilihan ini menjadi perdebatan karena penyanggah pelaporan dengan eksponensial beralasan bahwa mikroorganisme tidak dapat dituliskan dalam bentuk 2,3 karena satu sel tidak dapat dibagi lagi. Namun ini hanya merupakan masalah pilihan bentuk pelaporan angka dan tidak mengurangi substansi dasarnya. Bentuk 2,3 × 10³ tetaplah berarti sebanyak 23.000 ‘sel’, bukan bermakna 2,3 ‘sel’ dikali 1000.

12. Rangkuman

Belum terdapat suatu keseragaman (harmonized) cara mengitung koloni antar prosedur baku sehingga untuk sampel dengan matriks yang sama (misalnya air) seseorang dapat memilih diantara dua referensi metode (SM 9215 atau ISO 8199) untuk diadopsi. Berikut tabel yang merangkum perbedaan syarat-syarat perhitungan koloni dari berbagai metode acuan.

Tabel 2. Rangkuman perbandingan peraturan perhitungan koloni dari tiga metode baku yang diacu. Diambil dari dokumentasi pribadi.

BAM Ch.3 (FDA, 2001)
N = (∑C)/((1.n1)+(0,1.n2).(d))
koloni/cawan	pelaporan
0	<1.d*
1-24	<25.d*
25-250	(∑C)/((1.n1)+(0,1.n2).(d))
251-6500	(∑C)/((1.n1)+(0,1.n2).(d)) *
>6500	>100.65.d*
pembulatan	jika z 6-9 maka y ↑
xyz→xy	jika z 1-4 maka y ↓
	jika z 5 dan y genap maka y ↓
	jika z 5 dan y ganjil maka y ↑
ISO 8199 (ISO, 2005)
Cs = (Z / Vtot) . Vs
0	<1/Vtot
1-3	<4.d*
4-9	(Z / Vtot) . Vs *
10-300	(Z / Vtot) . Vs
>300	>300/d*
pembulatan	jika z 5-9 maka y ↑
xyz→xy	jika z 1-4 maka y ↓
SM 9215 (APHA, AWWA, & WEF, 2004)
∑C/Vtot
0	<1/Vtot
1-29	abaikan dan catat hasil
30-300	∑C/Vtot
301-650	∑C(13 transek) x 5 / Vtot*
651-6500	∑C/Vtot*
>6500	>100.65.d*
pembulatan	jika z 5-9 maka y ↑
xyz→xy	jika z 1-4 maka y ↓
APC memakai metode pour plate pada cawan 65 cm2
* : jumlah perkiraan / EAPC
↓/↑ : dibulatkan ke bawah / ke atas
xyz : simbol 3 angka penting

Indra Pradhika, 2018.

Referensi :

AOAC OM 17.2.01. 966.23 Microbiological methods, AOAC Official Method of Analysis Microbiological Methods (2005).

AOAC OM 17.5.02 975.55 Staphylococcus aureus in foods, Surface plating method for isolation and enumeration, AOAC Official Method of Analysis Microbiological Methods. (2005).

APHA, AWWA & WEF Standard method for examination of water and wastewater 9215: Heterothropic plate count. (2004).

APHA, AWWA & WEF Standard Method for Examination of Water and Wastewater 9610 C: Detection of Fungi. (2000).

ASTM D5465-93 Standard practice for determining microbial counts from waters analyzed by plating methods. (1998).

FDA-BAM Chapter 12, Staphylococcus aureus. (2001). Diperoleh dari: www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm071429.htm

FDA-BAM Chapter 14, Bacillus cereus. (2001). Diperoleh dari: www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070875.htm

FDA-BAM Chapter 16, Clostridium perfringens. (2001). Diperoleh dari: www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070878.htm

FDA-BAM Chapter 18, Yeast, Mold and Mycotoxins. (2001). Diperoleh dari: www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm071435.htm

FDA-BAM Chapter 3, Aerobic Plate Count. (2001). Diperoleh dari: www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm063346.htm

ISO 21527-2:2008, Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal Methods for the enumeration of yeast and moulds – Part 2: Colony count technique in products with water activity less than or equal to 0,95. (2008).

ISO 21528-1:2004. Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal methods for the detection and enumeration of Enterobacteriaceae – Part 1: Detection and enumeration by MPN techniques with pre-enrichment. (2004).

ISO 6888-1:1999. Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal methods for the enumeration of coagulase-positive Staphylococci (Staphylococcus aureus and other species) – Part 1: Technique using Baird-Parker agar medium. (1999).

ISO 7218:2007(E) Microbiology of food and animal feeding stuffs – General requirements and guidance for microbiological examinations. (2007).

ISO 8199: 2005 Water quality — General guidelines on the enumeration of microorganisms by culture. (2005).

ISO/TR 13843:2001 Water Quality – Guidance on validation of microbiological methods. (2001).

USP30-NF25 2021 Microbial Enumeration Test – Nutritional and Dietary Supplements. (2007). United States Pharmacopeial.