Kesalahan Umum Metode MPN

1. Kombinasi seri tabung diluar tabel

Berdasarkan prinsip pengenceran pada MPN maka seharusnya atau sebaiknya jumlah tabung positif pada pengenceran lebih pekat akan semakin banyak (1/10>1/100>1/1000), misalnya 5-3-1. Hal ini dikarenakan setiap pengenceraan mengurangi jumlah mikroorgansime target dan akibatnya semakin kecil kesempatannya untuk membuat tabung menjadi positif. Namun seringkali hasil yang didapat tidak sesuai dengan logika peluang, seperti kombinasi 5-3-4 yang menghasilkan nilai 210. Bisa saja banyak sel tidak sengaja terambil dan memperbanyak tabung positif di pengenceran selanjutnya atau homogenisasi tidak berlangsung sempurna. USDA/FSIS (2008) menyarankan untuk mengulangi analisis jika diperoleh kombinasi tabung yang tidak terdapat dalam tabel (misalnya untuk 3 seri tabung : 0-2-3, 1-2-3, 2-1-3 dll.). Diasumsikan bahwa hasil tersebut mencurigakan karena kontaminasi atau kesalahan praktik lainnya (hal. 2).

Dalam tabel MPN dalam metode MPN yang diterbitkan AOAC (AOAC OM 966.24, 2005:Ch.17,hal. 5) mengenai kombinasi tabung seperti ini diberikan catatan khusus. Misalnya untuk kombinasi 0-1-2, 1-3-2, 2-0-3 dll. Catatan ini menyarankan bahwa terdapat aspek ketidakemungkinan yang tinggi jika mendapatkan kombinasi ini yang mengindikasikan bahwa nilai MPN yang diperoleh dapat lebih rendah dibandingkan konsentrasi sebenarnya.

ISO 7218 (2007) menjabarkan tentang pembagian kategori kemungkinan nilai MPN berdasarkan kombinasi tabung positif dari tabel MPN. Nilai MPN yang diperoleh dibagi menjadi empat kategori yaitu kategori 1, kategori 2, kategori 3 dan kategori 0. Kategori 1 memiliki kemungkinan paling tinggi untuk diperoleh, berturut-turut menurun sampai kategori 0. Disarankan untuk ditentukan terlebih dahulu kategori mana yang dinyatakan diterima (acceptable), misalnya hanya kategori 1, 1 dan 2 atau 1,2,dan 3. Jika hasil MPN digunakan untuk menentukan keputusan yang lebih penting maka sebaiknya dipakai kategori 1 atau 1 dan 2 saja sebagai batas keberterimaan. Sedangkan kategori 0 dapat dipertimbangkan sebagai nilai yang mencurigakan. Tedapat pola mengenai kombinasi tabung dan pengelompokan kategorinya. Semakin baik kategori nilai MPN maka kombinasi tabung positif yang terjadi akan semakin logis (mendekati kenyataan) (hal. 61).

2. Tabung negatif palsu dan positif palsu

Tabung negatif palsu mungkin terjadi jika mikroorganisme target yang terdapat pada tabung gagal menghasilkan indikasi yang disyaratkan metode untuk dinyatakan sebagai tabung positif. Beberapa sebab yang dapat diidentifikasi diantaranya adalah:

(1) Terdapat bahan yang dapat mematikan dan menghambat mikroorganisme atau berinterferensi dengan media, misalnya Chlorine pada air.

(2) Gagalnya uji penegas dan pelengkap dalam mengidentifikasi mikroorganisme terkait karena tidak semua (100 %) strain mampu dideteksi metabolismenya dengan prosedur tertentu sehingga tabung penduga yang semula positif dinyatakan menjadi negatif, misalnya pada metode ISO 7251: 2005 terdapat catatan bahwa strain patogen E.coli tidak mampu tumbuh pada suhu 44°C saat dikonfirmasi dengan pada EC broth.

(3) Tabung durham dilingkupi atau tenggelam oleh substrat sampel padat dari homogenat sampel sehingga gas tidak mampu terperangkap. Disarankan tetap melihat pembentukan gas dengan menggoyang tabung sehingga timbul buih (effervescence).

Sedangkan tabung positif palsu dapat disebabkan oleh :

(1) Terjadinya tabung positif oleh mikroorganisme non target, misalnya menurut Hussong et al. (1981) beberapa strain Bacillus spp. dan Aeromonas spp. mampu pada membentuk gas pada tahap penduga (hal. 35). Oleh karena itu pellicle (substansi lengket bakteri; film) tidak boleh terambil saat diinokulasikan lagi pada tahap penegas dan Coliform umumnya tidak membentuk pellicle.

(2) Kontaminasi oleh bakteri lain termasuk oleh isolat kontrol uji, sehingga disarankan penanaman isolat kontrol dilakukan setelah analisis.

(3) Kontaminasi silang dari tabung yang lain. Oleh karena itu lebih tepat menggunakan inoculation stick sekali buang saat uji penegas jika pembakaran jarum inokulum berkali-kali dirasa kurang menjamin sterilisasi.

(4) Masih terdapatnya udara pada tabung durham karena kesalahan preparasi media. Jika terdapat udara pada durham dan tidak timbul buih maka umumnya adalah reaksi negatif.

Indra Pradhika, 2018.

Referensi :

AOAC OM 17.2.01 966.24 Coliform group and Escherichia coli microbiological (MPN) method. AOAC Official Method of Analysis Microbiological Methods. (2005).

Hussong, D., Damaré, J. M. Weiner, R. M. & Colwell, R.R. (1981). Bacteria associated with false-positive most-probable-number Coliform test results for shellfish and estuaries. Appl Environ Microbiol 41 (1), 35–45. Abstrak diperoleh dari: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7013700

ISO 7218:2007(E) Microbiology of food and animal feeding stuffs – General requirements and guidance for microbiological examinations. (2007).

ISO 7251:2005. Microbiology of food and animal feeding stuffs – horizontal methods for the detection and enumeration of presumptive Escherichia coli – most probable number techniques. (2005).

United Nations Environment Programme – World Health Organization. (1996). Water quality monitoring – Apractical guide to the design and implementation of freshwater quality studies and monitoring programmes, Chapter 10 – Microbiological analyses. Diperoleh dari: www.who.int/water_sanitation_health/resourcesquality/waterqualmonitor.pdf

USDA/FSIS MLG Appendix 2.05 Most Probable Number procedure and tables. (2008). Diperoleh dari: https://www.fsis.usda.gov/wps/portal/fsis/topics/science/laboratories-and-procedures/guidebooks-and-methods/microbiology