Pemilihan Jumlah Seri Tabung MPN
Telah diketahui bahwa MPN memiliki beberapa pilihan cara dalam perhitungannya berdasarkan jumlah tabung setiap serinya sesuai tabel yang tersedia yaitu 3, 5, 8 dan 10 seri tabung. Inti dari metode MPN adalah mendapatkan tingkat pengenceran yang kadang-kadang tapi tidak selalu mengandung mikroorganisme hidup. Alasan inilah yang sangat mempengaruhi pemilihan jumlah seri tabung pada metode MPN tersebut. Menurut ISO 7218 (2007) pemilihan konfigurasi seri tabung ini juga dipengaruhi oleh jumlah mikroorganisme yang diperkiraan, persyaratan peraturan yang berlaku, presisi yang dibutuhkan dan pertimbangan praktik lainnya (hal. 45).
ISO 7218 (2007) dan ISO 8199 (2005) juga membagi sistem inokulasi metode MPN menjadi beberapa kategori yaitu:
- Sistem pengenceran tunggal (single dilution system): digunakan jika perkiraan konsentrasi mikroorganisme sangat kecil sampai sedang yang memakai seri tabung tunggal dengan porsi uji yang sama (volume inokulum sama). Jika diperkirakan perbandingan antara jumlah mikroorganisme maksimum dan minimum adalah <25 maka 10 tabung paralel adalah jumlah paling kecil yang diaplikasikan. Jika memakai 50 tabung paralel maka perbandingan 200 adalah batasannya. Sistem pengenceran ganda (multiple dilution system): digunakan jika konsentrasi mikroorganisme tidak diketahui atau memiliki variasi yang besar. Penanamannya dilakukan dengan sejumlah seri tabung untuk beberapa tingkat pengenceran. Inokulum yang dimasukkan sebaiknya akan menghasilkan tabung positif dan negatif pada sistem ini. Jika penentuan nilai MPN memakai tabel maka hasilnya dibatasi pada konfigurasi tabel tersebut.
- Sistem pengenceran simetrik (symmetric dilution system): konfigurasi yang paling sering diaplikasikan dari sistem ini adalah tiga atau lima tabung paralel setiap pengencerannya. Presisi yang diperoleh akan menurun tajam jika terjadi penurunan jumlah tabung yang digunakan setiap pengencerannya. Sistem pengenceran non-simetrik (non–symmetric dilution system): pada sistem ini tingkat pengenceran yang berbeda memiliki jumlah tabung yang tidak sama.
Pemilihan ini bergantung kepada beberapa faktor yaitu jumlah mikroorganisme yang diperkirakan pada sampel, persyaratan peraturan terkait, presisi yang dibutuhkan dan pertimbangan praktik lainnya. ISO 7218 membagi sistem ini menjadi empat sesuai penjelasan diatas, tetapi untuk sistem pengenceran ganda tidak ditampilkan contoh tabel yang digunakan sehingga lebih baik sistem simetrik dan non-simetrik dikategorikan sebagai sistem pengenceran ganda sesuai gambar dibawah ini.
Gambar 1. Ilustrasi berbagai sistem inokulasi metode MPN. Tabung pengenceran tidak ditampilkan karena inokulum dapat diambil langsung dengan pipet atau diencerkan terlebih dahulu untuk mendapatkan inokulum akhir yang sesuai. Diambil dari dokumentasi pribadi.
Sistem metode MPN yang paling banyak digunakan adalah Symmetric dilution system yaitu metode MPN yang menggunakan banyak tabung secara paralel setiap pengencerannya. Semakin banyak jumah tabung yang digunakan setiap serinya maka semakin presisi nilai yang dihasilkan. Disarankan untuk menggunakan 5 atau lebih tabung setiap serinya jika menginginkan presisi yang lebih baik. FDA BAM Ch.4 (2002) menyatakan bahwa 3 seri tabung umumnya digunakan untuk sampel pangan, 5 seri tabung untuk sampel air dan kerang, sedangkan 10 seri tabung (sistem pengenceran tunggal) dipakai untuk menguji air dalam kemasan (bottled water) atau sampel lain yang diperkirakan jarang terkontaminasi (mengandung sedikit mikroorganisme).
Untuk pengujian air dalam kemasan (bottled water) digunakan metode 10 tabung. Diambil 100 mL sampel air dan inokulasikan masing-masing 10 mL sampel yang tidak diencerkan ke dalam 10 tabung 2× LST (double strength) dan tiap tabung berisi 10 mL media. Tabung diinkubasi pada 35°C. selama 24±2 jam. Jika hasil negatif maka tabung diinkubasi lagi selama 24 jam. Semua tabung positif diuji dengan tahap konfirmasi yaitu dengan menanamkannya pada BGLB menggunakan jarum inokulasi. Kemudian tabung diinkubasi pada 35°C. selama 48±2 jam. Hasil MPN diketahui menggunakan tabel MPN 10 tabung (FDA BAM Ch.4, 2002, bag. III).
UNEP/WHO menyarankan jumlah sampel yang diinokulasikan dan jumlah seri tabung yang dipakai untuk analisis berbagai jenis sampel air pada tabel berikut.
Tabel 1. Tabel seri tabung dan volume sampel yang digunakan untuk analisis MPN berbagai jenis sampel air. Diadaptasi dari “Water quality monitoring – a practical guide to the design and implementation of freshwater quality studies and monitoring programmes, Chapter 10 – Microbiological analyses“, oleh UNEP/WHO, 1996, hal. 7.
| Jenis sampel | Volume sampel (mL) | |||||
| 50 | 10 | 1 | 0,1 | 0,01 | ||
| Air minum olahan (treated dinking water) | Jumlah seri tabung | 1 | 5 | – | – | – |
| Air minum olahan sebagian (partially treated dinking water) | – | 5 | 5 | 5 | – | |
| Air yang dimungkinkan terjadinya kontak langsung (Recreational water) | – | 5 | 5 | 5 | – | |
| Sumber air yang dilindungi (Protected-source water) | – | 5 | 5 | 5 | – | |
| Air permukaan (Surface water) | – | – | 5 | 5 | 5 | |
Menurut USDA/FSIS (2008) untuk mengantisipasi jika jumlah mikroorganisme dalam sampel >10 Growth Unit/g (mL) maka disarankan menanam sampel 10 mL pada 3 seri tabung, 1 mL pada 3 seri tabung lalu selanjutnya dilakukan pengenceran sampai 1/104 dan tiap pengenceran ditanam 1 mL pada 3 seri tabung (hal. 3).
Gambar 2. Skema penanaman metode MPN yang disarankan oleh USDA/FSIS (2008, hal. 3). Jika mengikuti petunjuk ini maka kemungkinan memperoleh tabung positif yang “kadang-kadang tapi tidak selalu” semakin besar. Diambil dari dokumentasi pribadi.
Terdapat pilihan lain untuk tempat inokulum selain menggunakan tabung yaitu memakai multiwell plate (atau cara lain yang sebanding) jika “well/sumuran” disini menggambarkan (berfungsi sebagai) tabung. Kelebihannya adalah jumlah well yang banyak dapat dengan mudah diinokulasikan (misalnya 3 pengenceran bertingkat dan diinokulasikan ke 32 well setiap pengenceran). Presisi cara ini dapat mendekati presisi hitungan cawan atau teknik filtrasi membran. Sedangkan kekurangannya adalah volume inokulum yang kecil (umumnya 0,2 mL/well). Bagaimanapun juga, semuanya tergantung jumlah multiwell plate dan ukuran sumuran tersebut. Tersedia multiwell plates dengan jumlah 12×5 well, 24×3 well dan 48×1 well. Semakin tinggi ukuran (volume) well maka umumnya akan menurunkan jumlah well yang juga akan menurunkan tingkat presisinya (ISO 8199, 2005, hal. 16).
Banyak metode lain yang dapat diacu untuk analisis MPN Coliform dan atau E.coli. Umumnya terdiri dari beberapa tahap pengujian. Berikut tabel perbandingan metode analisis MPN.
Tabel 2. Perbandingan metode MPN untuk Coliform dan atau E.coli berdasarkan beberapa standar internasional. Diolah dari: ISO 4831, 2006; ISO 7251, 2005; AOAC OM 966.24, 2005; dan APHA, AWWA, & WEF SM 9221, 2006.
| Referensi metode | ISO 4831:2006 | ISO 7251:2005 | AOAC OM 966.24 | APHA, AWWA, & WEF SM 9221 |
|---|---|---|---|---|
| Uji | Coliform | E.coli | Coliform dan E.coli | Coliform dan E.coli |
| Matriks | Pangan dan pakan | Pangan dan pakan | Pangan | Air |
| Inokulasi dan jumlah seri tabung |
Padat :
3×3 seri tabung: 10 mL dari 1/10 pada 3 seri tabung DS 1 mL dari 1/10 pada 3 seri tabung SS 1 mL dari 1/100 pada 3 seri tabung SS Cair : Dari 1,1/10,1/100 |
Padat :
3×3 seri tabung: 10 mL dari 1/10 pada 3 seri tabung DS 1 mL dari 1/10 pada 3 seri tabung SS 1 mL dari 1/100 pada 3 seri tabung SS Cair : Dari 1,1/10,1/100 |
3×3 seri tabung :
1 mL dari 1/10 pada 3 seri tabung 1 mL dari 1/100 pada 3 seri tabung 1 mL dari 1/1000 pada 3 seri tabung |
Air minum :
1×10 seri tabung : @ 10 mL 1×5 seri tabung: @ 20 mL 1×1 seri botol: @ 100 mL Bukan air minum : Sampel diencerkan terlebih dahulu. |
| Uji penduga Coliform dan E.coli |
LST (DS); 30/37oC ; 24±2 jam
LST (SS); 30/37oC ; 24+24±2 jam |
LST (DS+SS); 37oC ; 24+24±2 jam | LST; 35±0,5oC ; 24+24±2 jam | LST (DS); 35±0,5oC ; (24±2)+(24±3) jam |
| Uji penegasan Coliform | BGLB; 30/37oC ; 24+24±2 jam | (-) | BGLB; 35±0,5oC ; 48±2 jam |
BGLB; 35±0,5oC ; 48±3 jam
atau – LES Endo Agar – Mc Conkey – Pewarnaan gram – LST |
| Uji penegasan Fecal Coliform | (-) | EC broth; 44oC ; 24+24±2 jam | EC broth; 45,5±0,02oC ; 48±2 jam | EC broth; 45,5±0,2oC ; 24±2 jam |
| Uji pelengkap E.coli | (-) | Uji indol : peptone water; 44oC ;48±2 jam |
– Pewarnaan Gram
– Penanaman LST – Uji indol – Uji methyl red – Uji Voges Proskauer – Uji penggunaan citrate |
EC-MUG; 45,5±0,2oC ; 24±2 jam
atau – Uji GAD (glutamate decarboxylase) – Uji Indol |
| Tabel yang digunakan | Tabel MPN 3 seri tabung dengan inokulum 0,1 g, 0,01 g, dan 0,001 g. atau 1 g, 0,1 g dan 0,01 g. | Tabel MPN 3 seri tabung dengan inokulum 0,1 g, 0,01 g, dan 0,001 g. atau 1 g, 0,1 g dan 0,01 g. | Tabel MPN 3 seri tabung dengan inokulum 0,1 g, 0,01 g, dan 0,001 g. |
Tabel MPN 10 tabung dengan inokulum 10 mL;
Tabel MPN 5 tabung dengan inokulum 20 mL; Interpretasi P/A. |
|
Catatan :
SS : single strength DS : double strength P/A : presence/absence |
||||
Jika pengujian Coliform dan E.coli dilakukan sesuai standar baku maka memang diperlukan tahap konfirmasi yang bertingkat dan seringkali membutuhkan waktu yang panjang. Çakir et al. (2002) membuktikan bahwa tidak perlunya dilakukan beberapa uji konfirmasi saat perhitungan Coliform dan E.coli. Konfirmasi yang dapat diabaikan adalah uji pada BGLB untuk mengkonfirmasi Coliform setelah uji LST dan uji indol untuk mengkonfirmasi E.coli setelah uji MUG. Uji konfirmasi ini tidak memberikan dampak yang signifikan terhadap hasil akhir hitungan (hal. 1049).
Indra Pradhika, 2018.
Referensi :
AOAC OM 17.2.01 966.24 Coliform group and Escherichia coli microbiological (MPN) method. AOAC Official Method of Analysis Microbiological Methods. (2005).
APHA, AWWA & WEF Standard method for examination of water and wastewater 9221: Multiple-tube fermentation technique for members of the Coliform group. (2006).
Çakir, I., Doğan, H. B., Başpinar, E., Kiven, F., & Halkman, A. K. (2002). The need for confirmation in coliform and E.coli Enumeration in food. Turkish Jurnal Veterinary & Animal Sciences Vol. 26, 1049-1053. Diperoleh dari: https://www.researchgate.net/publication/297899761_The_need_for_confirmation_in_coliform_and_E-coli_enumeration_in_foods
FDA-BAM Chapter 4: Enumeration of Escherichia coli and the Coliform Bacteria. (2002). Diperoleh dari: www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm064948.htm
ISO 4831:2006. Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal methods for the detection and enumeration of Coliforms – most probable number techniques. (2006).
ISO 7218:2007(E) Microbiology of food and animal feeding stuffs – General requirements and guidance for microbiological examinations. (2007).
ISO 7251:2005. Microbiology of food and animal feeding stuffs – horizontal methods for the detection and enumeration of presumptive Escherichia coli – most probable number techniques. (2005).
ISO 8199: 2005 Water quality — General guidelines on the enumeration of microorganisms by culture. (2005).
United Nations Environment Programme – World Health Organization. (1996). Water quality monitoring – Apractical guide to the design and implementation of freshwater quality studies and monitoring programmes, Chapter 10 – Microbiological analyses. Diperoleh dari: www.who.int/water_sanitation_health/resourcesquality/waterqualmonitor.pdf
USDA/FSIS MLG Appendix 2.05 Most Probable Number procedure and tables. (2008). Diperoleh dari: https://www.fsis.usda.gov/wps/portal/fsis/topics/science/laboratories-and-procedures/guidebooks-and-methods/microbiology-laboratory-guidebook
nice info