Parameter yang perlu diuji untuk media padat adalah produktivitas (kuantitatif, kualitatif), selektivitas (kualitatif) dan spesifisitas (kualitatif).

1. Produktivitas kuantitatif

Berikut prosedur penentuan produktivitas secara kuantitatif untuk media padat selektif atau non-selektif.

(1) inokulum dengan konsentrasi 80-120 CFU disiapkan.

(2) inokulum diinokulasikan ke media uji dan media referensi sesuai teknik yang diacu (spread plate, pour plate, atau filtrasi membran) secara duplo.

(3) cawan diinkubasi sesuai Tabel 2 (pada Jaminan Kualitas Media).

(4) koloni dihitung pada kedua media dan tentukan Pr (Productivity ratio) sesuai rumus Pr = Ns/No, dimana Ns adalah jumlah total koloni yang diperoleh pada media uji dan No adalah jumlah total koloni yang diperoleh pada media referensi, dari satu cawan atau lebih dan sekitar 100 CFU.

(5) jika Pr ≥ 0,5 maka batch media dapat diterima (antara media selektif uji dengan media non-selektif referensi). Jika Pr ≥ 0,7 maka batch media dapat diterima (antara media non-selektif uji dengan media non-selektif referensi). Jika diketahui Pr ≥ 1,4 maka harus didentifikasi alasannya

(ISO 11133, 2014, hal. 22-24).

Pr yang melebihi 1,4 mengindikasikan jumlah media uji jauh lebih besar daripada media referensi yang dapat dimungkinkan karena kecilnya recovery media referensi yang digunakan. Pengujian produktivitas media referensi yang dijadikan acuan ini bersandar kepada media referensi yang telah divalidasi sebelumnya menggunakan CRM. Penjelasan lebih lengkap dapat dilihat pada bagan di dalam gambar berikut.

Gambar 1. Prosedur penentuan produktivitas media padat secara kuantitatif berdasarkan ISO 11133: 2014 (bag. 7.2). Diambil dari dokumentasi pribadi.

Khusus untuk produktivitas media padat secara kuantitatif, nilai Pr yang diperoleh secara kontinyu dapat dibuat grafik kontrol untuk mengetahui kecenderungan data Pr media dari setiap batch pembuatan. Berikut prosedur pembuatan grafik kontrol ini.

(1) grafik dapat dibuat dengan minimal 10 batch data Pr dengan hari, operator yang berbeda. Jika digunakan 20 data maka dapat dihasilkan kesimpulan yang lebih terpercaya.

(2) disiapkan inokulum sebanyak 100±20 CFU/0,1 mL.

(3) ditentukan rata-rata Ns ke-i sebagai x_i CFU/0,1 mL (i = 1,2,3,…., n), dimana n minimum 10 dan lebih baik 20.

(4) rata-rata nilai Pr (r avr) ditentukan dengan rumus: r avr = 1/n Σ r_i ((r₁+r₂+r₃+…r_n)/n)

kemudian kisaran rata-rata nilai Pr (R avr) ditentukan dengan rumus: r avr = 1/(n-1) Σ |r_i – r_i-1|

Dimana: i adalah nomor uji, n adalah jumlah total uji dan r_i adalah nilai Pr ke-i.

(5) ditentukan standar deviasinya dengan rumus: s = 0,8865×R avr = R avr/1,128

(6) ditentukan batas 95 % (±2) dan batas 99% (±3) dari hasil distribusi.

(7) batch media yang baru diterima jika persyaratan berikut ini masuk kisaran, yaitu volume, penampakan, homogenitas, warna, konsistensi gel, kandungan air dan nilai Pr.

(8) batch media yang baru tidak diterima jika Pr diluar kisaran, 1 data melewati batas ±3, 2 data melewati batas ±2, 6 data berurutan konsisten naik atau turun, 9 data berurutan berada diatas atau dibawah mean

(ISO 11133, 2014, hal. 78-79).

Contoh perhitungan ini dapat dilihat pada penjelasan berikut.

Contoh pembuatan grafik kontrol dari nilai Pr (Productivity ratio) berdasarkan ISO 11133: 2014 (Annex G). Pembuatan media TSA, dengan inokulum standar 110 CFU/0,1 mL.

i	no batch	yi (CFU)	xi (CFU)	ri	|ri-ri-1|
1	9/22/2016	110	95	0.86	–
2	9/23/2016	110	102	0.93	0.06
3	9/24/2016	110	94	0.85	0.07
4	9/25/2016	110	97	0.88	0.03
5	9/26/2016	110	105	0.95	0.07
6	9/27/2016	110	68	0.62a	–
7	9/28/2016	110	98	0.89	0.06b
8	9/29/2016	110	105	0.95	0.06
9	9/30/2016	110	103	0.94	0.02
10	10/1/2016	110	116	1.05	0.12
11	10/2/2016	110	95	0.86	0.19
12	10/3/2016	110	90	0.82	0.05
13	10/4/2016	110	89	0.81	0.01
14	10/5/2016	110	116	1.05	0.25
15	10/6/2016	110	114	1.04	0.02
16	10/7/2016	110	110	1.00	0.04
17	10/8/2016	110	114	1.04	0.04
18	10/9/2016	110	98	0.89	0.15
19	10/10/2016	110	88	0.80	0.09
20	10/11/2016	110	102	0.93	0.13

^a: nilai diluar 0,7-1,4 sehingga tidak dimasukkan ke perhitungan.

^b: nilai 0,06 diperoleh dari pengurangan r₇ dan r₅.

1. ditentukan rata-rata Pr (r avr):

r avr = 1/n Σ r_i ((r₁+r₂+r₃+…r_n)/n)

r avr = ((0,86+0,93+0,85+…0,93)/19)

r avr = ((17,5)/19)

r avr = 0,92

2. ditentukan rata-rata selisih Pr (R avr):

r avr = 1/(n-1) Σ |r_i – r_i-1|

r avr = ((0,07+0,08+0,03+…0,13)/18)

r avr = ((1,43)/18)

r avr = 0,08

3. ditentukan standar deviasi:

S = 0,8865 × 0,08 = 0,071

4. ditentukan 95% (±2) dan 99 % (±3) batas kepercayaan (CL).

0,92 ± 2 × 0,071 = 0,92 ± 0,14 = 0,78 sampai 1,06

0,92 ± 3 × 0,071 = 0,92 ± 0,21 = 0,71 sampai 1,13

Jika diplot pada grafik maka dapat menjadi grafik berikut.

Grafik 1. Grafik kontrol dari nilai Pr (Productivity ratio) berdasarkan ISO 11133: 2014 (Annex G). Diambil dari dokumentasi pribadi.

5. batch media yang baru tidak diterima jika: satu data melewati batas ±3, dua data melewati batas ±2, enam data berurutan konsisten naik atau turun, atau sembilan data berurutan berada diatas atau dibawah mean.

2. Produktivitas, selektivitas dan spesifisitas kualitatif

Berikut prosedur penentuan produktivitas, slektivitas dan spesifisitas secara kualitatif untuk media padat.

(1) satu garis mikroorganisme yang sesuai digoreskan (1 µL) pada media uji (beberapa bakteri dapat digoreskan pada satu cawan)

(2) cawan diinkubasi sesuai Tabel 2 (pada Jaminan Kualitas Media).

(3) koloni diskret yang terbentuk diinterpretasi dengan angka 0 = jika tidak ada pertumbuhan, 1 = jika pertumbuhan tidak baik (lemah), dan 2 = jika pertumbuhan baik

(ISO 11133, 2014, hal. 24-25).

Penjelasan lebih lengkap dapat dilihat pada bagan di dalam gambar berikut.

Gambar 2. Prosedur penentuan produktivitas, selektivitas dan spesifisitas media padat secara kualitatif berdasarkan ISO 11133: 2014 (bag. 7.4). Diambil dari dokumentasi pribadi.

3. Metode ekometri

Terdapat metode pengujian untuk media padat secara kuantitatif lain yang lebih praktis dilakukan (tanpa preparasi inokulum dengan jumlah tertentu), yang disebut dengan metode ekometri. Metode ini tidak termasuk ke dalam persyaratan Tabel 2 (pada Jaminan Kualitas Media) tetapi tetap dapat dijadikan cara pengujian alternatif selain yang telah dijelaskan sebelumnya.

Berikut prosedur metode ekometri untuk media padat.

(1) Satu cawan media yang diuji disiapkan mewakili dari satu batch pembuatan media.

(2) Bakteri kontrol positif yang digunakan untuk menguji media disiapkan. Setiap media selektif memiliki bakteri kontrol yang sesuai.

(3) Bakteri kontrol positif diumbuhkan pada medium cair yang sesuai lalu diinkubasi sesuai prosedur yang diadopsi. Konsentrasi bakteri yang akan diinokulasikan sebaiknya berada pada fase stasioner.

(4) Templat 4 garis paralel dibuat dengan interval 0,5 cm yang terdiri dari sektor A, B dan C pada bagian bawah cawan menggunakan marker. Kemudian satu garis tunggal zig-zag berkelanjutan pada sektor D.

(5) Ujung jarum inokulum loop dicelupkan ke dalam kultur cair. Jika terdapat kelebihan cairan maka tekan ujung loop tiga kali pada dinding tabung. Ujung loop digoreskan secara konsisten pada media uji. Terbentuknya tetesan yang berlebihan pada sektor A sebaiknya dicegah.

(6) Ketika melakukan penggoresan (streaking) sudut antara jarum inokulum dan permukaan media agar dijaga dengan kemiringan 20-30 derajat. Ujung loop dibakar saat berganti sektor.

(7) Cawan diinkubasi pada suhu dan waktu yang sesuai dengan prosedur atau metode standar yang digunakan.

(8) Pertumbuhan koloni pada tiap garis goresan diukur. Jika terdapat pertumbuhan sepanjang garis maka garis tersebut benilai 1. Nilai total adalah 16 (terdapat 16 garis). Jika pertumbuhan hanya setengah garis maka garis tersebut bernilai 0,5. Jika tidak terdapat pertumbuhan atau pertumbuhan kurang dari setengah garis maka garis tersebut bernilai 0.

(9) Nilai dari setiap garis dijumlah sehingga mendapatkan nilai growth index (Gi). Jika Gi ≥6 maka kinerja media dapat diterima dan disimpulkan bahwa kinerja media memuaskan dan media dapat dipakai

(ISO 11133-2, 2003, hal. 6-7; Corry et al., 2003, hal. 643-644).

Gambar 3. Pola inokulasi metode ekometri dan derajat jarum inokulum loop saat penggoresan. Diadaptasi dari “ISO 11133-2: 2003 Microbiology of Food and Animal Feeding Stuffs — Guidelines on Preparation and Production of Culture Media — Part 2: Practical Guidelines on Performance Testing of Cluture Media”, oleh ISO, 2003, hal. 7.

Indra Pradhika, 2018

Referensi :

Corry, J. E. L., Curtiss, G. D. W. & Baird, R. M. (2003). Handbook of culture media for food microbiology (Vol. 35). Amsterdam: Elsevier.

ISO 11133: 2014 Microbiology of food, animal feed and water — Preparation, production, storage and performance testing of culture media. (2014).

ISO/TS 11133-2:2003 Microbiology of food and animal feeding stuffs — Guidelines on preparation and production of culture media — Part 2: Practical guidelines on performance testing of cluture media (Edisi ke-2). (2009).