MPN adalah suatu metode perhitungan mikroorganisme berdasarkan data kualitatif hasil pertumbuhan mikroorganisme pada medium cair spesifik dalam seri tabung untuk memperoleh kisaran data kuantitatif jumlah mikroorganisme tersebut (MPN/mL (g)). MPN merupakan suatu metode uji pengenceran bertingkat (serial dilution) untuk mengukur konsentrasi mikroorganisme target dengan perkiraan. SNI 01-2332.1 (2006) mendeskripsikan MPN sebagai metode untuk menghitung jumlah mikrob dengan menggunakan medium cair pada tabung reaksi yang pada umumnya setiap pengenceran menggunakan 3 atau 5 seri tabung dan perhitungan yang dilakukan merupakan tahap pendekatan secara statistik (hal. 7).

Prinsip utama metode ini adalah mengencerkan sampel sampai tingkat tertentu sehingga didapatkan konsentrasi mikroorganisme yang pas/sesuai dan jika ditanam dalam tabung menghasilkaan frekensi pertumbuhan tabung positif “kadang-kadang tetapi tidak selalu”. Semakin besar jumlah sampel yang dimasukkan (semakin rendah pengenceran yang dilakukan) maka semakin “sering” tabung positif yang muncul. Semakin kecil jumlah sampel yang dimasukkan (semakin tinggi pengenceran yang dilakukan) maka semakin “jarang” tabung positif yang muncul. Semua tabung positif yang dihasilkan sangat tergantung dengan probabilitas sel yang terambil oleh pipet saat memasukkannya ke dalam media. Oleh karena itu, homogenisasi sangat mempengaruhi metode ini. Kombinasi kemunculan positif (ya) atau negatif (tidak) ini menggambarkan perkiraan konsentrasi mikroorganisme pada sampel sebelum diencerkan. Perubahan dari data positif atau negatif sampai menghasilkan angka dilakukan dengan proses perhitungan peluang. Jadi nilai MPN adalah suatu angka yang menggambarkan jumlah mikroorganisme yang memiliki kemungkinan paling tinggi.

Gambar 1. Kombinasi tabung positif yang didapat adalah 3 tabung positif dari pengenceran 1/10, 2 tabung positif dari pengenceran 1/100 dan 1 tabung positif dari pengenceran 1/1000. Angka MPN yang dihasilkan setelah dicocokkan dengan tabel adalah 150 MPN/g. Diambil dari dokumentasi pribadi.

Asumsi yang diterapkan dalam metode MPN adalah :

• Bakteri terdistribusi sempurna dalam homogenat sampel.
• Sel bakteri terpisah-pisah secara individual, tidak dalam bentuk rantai atau kumpulan (bakteri Coliform termasuk E. coli terpisah sempurna tiap selnya dan tidak membentuk rantai).
• Media yang dipilih telah sesuai untuk pertumbuhan bakteri target dalam suhu dan waktu inkubasi tertentu sehingga minimal satu sel hidup mampu menghasilkan tabung positif selama masa inkubasi pada media tersebut.
• Jumlah yang didapatkan menggambarkan bakteri yang hidup (viable) saja. Sel yang terluka dan tidak mampu menghasilkan tabung positif tidak akan terdeteksi.
• Setiap individu tabung memiliki data yang berdiri sendiri (independen).

Metode MPN dinilai berdasarkan perkiraan unit tumbuh (Growth Unit / GU) seperti CFU, bukan dari sel individu. Meskipun begitu baik nilai CFU atau MPN dapat menggambarkan seberapa banyak sel individu yang tersebar dalam sampel. FDA BAM appendix 2 (2001) menyatakan bahwa jika dalam metode MPN menggunakan target mikroorganisme yang dalam preparasi sampel dan pengencerannya tetap menunjukkan sel yang tidak terpisah dan berkelompok, maka nilai MPN sebaiknya dapat dinyatakan dalam perkiraan GU (Growth Units) atau CFU (Colony Forming Units) (para 2). Namun sebagian besar metode MPN digunakan untuk menghitung mikroorganisme target yang benar-benar terpisah individunya seperti Coliform dan E. coli.

Pemilihan media sangat berpengaruh terhadap metode MPN yang dilakukan. Umumnya media yang digunakan mengandung bahan nutrisi khusus untuk pertumbuhan bakteri tertentu. Misalnya dalam mendeteksi kelompok Coliform dapat menggunakan media Brilliant Green Lactose 2% Bile (BGLB) broth. Di dalam media ini mengandung lactose dan garam empedu (bile salt) yang hanya mengizinkan jenis ini untuk tumbuh. Jika terdapat ketidaksesuaian jenis media dan bakteri yang diinginkan maka metode ini akan menghitung bukan bakteri yang dituju. Untuk menghitung Coliform pada tahap pendugaan umumnya menggunakan Lauryl Sulphate Tryptose (LST) broth, sedangkan untuk menghitung E. coli pada tahap konfirmasi diperlukan media EC (Escherichia coli) broth.

USDA/FSIS (2008) menyebutkan bahwa nilai MPN sangat berguna untuk menentukan jumlah mikroorganisme dengan konsentrasi rendah (<100/g). Metode ini umumnya dipakai untuk menganalisis susu, pangan, air atau tanah yang dimana pada jenis sampel ini terdapat kemungkinan bahan partikulat sampel mampu mengganggu pertumbuhan koloni pada agar (hal. 1).

Beberapa kelebihan metode MPN yang diambil berdasarkan Oblinger dan Korburger (1975) adalah (1) Akurasi dapat ditingkatkan dengan memperbanyak tabung yang digunakan setiap pengencerannya. (2) Ukuran (volume) sampel yang cukup besar (dibanding plate count). (3) Sensitivitas umumnya cenderung lebih baik pada konsentrasi mikroorganisme yang sedikit daripada plate count. (4) Recovery umumnya lebih baik karena menggunakan media cair, tetapi tetap tergantung partikel sampel yang mungkin dapat mengganggu. (5) Jika medium spesifik yang sesuai dengan pertumbuhan bakteri target dapat dibuat maka perkiraan perhitungan MPN dapat dilakukan berdasarkan medium tersebut (hal. 541).

Indra Pradhika, 2018.

Referensi :

FDA-BAM Appendix 2: Most Probable Number from Serial Dilution. (2001). Diperoleh dari: www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm109656.htm

Oblinger, J. L. & Koburger, J.A. (1975). Understanding and teaching the most probable number technique. J Milk Food Technol 38(9), 540-545. doi: 10.4315/0022-2747-38.9.540

SNI 01-2332.1: 2006 Cara uji mikrobiologi- bagian 1: penentuan Coliform dan Escherichia coli pada produk perikanan. (2006). Diperoleh dari: http://sisni.bsn.go.id/index.php/sni_main/sni/detail_sni/22397

USDA/FSIS MLG Appendix 2.05 Most Probable Number procedure and tables. (2008). Diperoleh dari: https://www.fsis.usda.gov/wps/portal/fsis/topics/science/laboratories-and-procedures/guidebooks-and-methods/microbiology-laboratory-guidebook