Karakteristik kinerja yang disyaratkan dan harus dihitung untuk verifikasi metode mikrobiologi kuantitatif pada matriks pangan dan pakan adalah sebagai berikut. Pembagian dan persyaratan karakteristik kinerja verifikasi mikrobiologi dapat dibaca pada pembahasan Karakteristik Kinerja Verifikasi Metode Mikrobiologi.

Tabel 1. Karakteristik kinerja yang disyaratkan untuk verifikasi. Diadaptasi dari “ISO 16140-3: 2017. Microbiology of the food chain — Method validation — Part 3: Protocol for the verification of reference and validated alternative methods implemented in a single laboratory”, oleh ISO, 2017, hal: 15.

Metode	Parameter	Verifikasi implementasi	Verifikasi item
Kuantitatif	Intralaboratory reproducibility (sIR)	√	–
	Estimated bias (eBias)	–	√

Perhitungan Intralaboratory Reproducibility

Precision (keseksamaan) derajat kedekatan antar indikasi atau nilai yang diukur yang diperoleh dari replikasi pengukuran pada sampel yang sama dengan kondisi yang terspesifikasi (ISO 16140-1, 2016, hal. 7). Precision terdiri dari repeatability (keterulangan) dan reproducibility (ketertiruan). Intralaboratory reproducibility (ketertiruan dalam laboratorium) adalah ketertiruan data yang dilakukan pada laboratorium yang sama dengan kondisi analisis yang berbeda

Perhitungan intralaboratory reproducibility dalam verifikasi metode berdasarkan ISO 16140-3 (2017, hal. 20-25) dilakukan dengan menguji sampel yang dibagi menjadi dua setelah dihomogenisasi (porsi A dan porsi B) kemudian dianalisis dengan kondisi yang berbeda (waktu, alat, batch media dan teknisi yang berbeda).

Jika sampel memiliki jumlah mikroorganisme target yang diinginkan (analit) yang disebut kontaminasi alami, maka lebih baik dipilih sebagai sampel uji. Kontaminasi alami ini diharapkan sesuai dengan kisaran jumlah kontaminasi yang akan terdapat pada sampel yang akan dianalisis oleh laboratorium pengguna sehari-hari. Namun jika jumlahnya <10 CFU/g pada porsi uji, maka sampel lebih baik ditambah dengan kontaminasi buatan. Sumber kontaminasi buatan ini dapat diambil dari koleksi kultur laboratorium atau reference material komersial. Kultur ditanam pada media yang sesuai.

Jumlah sampel laboratorium minimal 10 dari batch yang berbeda tetapi dengan item pangan yang sama. Disarankan untuk menguji lebih dari 10 sampel laboratorium untuk menjaga kemungkinan jika terdapat kesalahan pengujian. Proses homogenisasi sampel padat atau cair dapat mengikuti prosedur yang telah dijelaskan pada bab Preparasi Sampel sebelumnya. Lebih jelasnya dapat dilihat pada bagan berikut.

Gambar 1. Bagan kerja interlaboratory reproducibility. Diadaptasi dari “ISO 16140-3: 2017. Microbiology of the food chain — Method validation — Part 3: Protocol for the verification of reference and validated alternative methods implemented in a single laboratory”, oleh ISO, 2017, hal. 21.

Data yang didapatkan hasil A (x_a) dan B (x_b) lalu di hitung dengan rumus :

s_IR = √(∑|y_ia – y_ib|² /2p)

keterangan :

s_IR : Intralaboratory Reproducibility

i : indeks sampel laboratorium, i = 1 sampai p (p ≥10)

p : jumlah sampel

y_ia – y_ib: selisih log10 (x_a) & log10 (x_b), y_a= log10 (x_a), y_b= log10 (x_b)

Contoh perhitungan :

Metode yang diverifikasi :

ISO 21528-2 Microbiology of the food chain – Horizontal method for the detection and enumeration of Enterobacteriaceae – Part 2: Colony-count technique

Kategori kisaran kontaminasi : 30-30.000 CFU/g

Kontaminasi buatan : E.coli

Kategori verifikasi : tiramisu

		CFU/g
spl (p)	Kntm. level	hasilA(xa)	hasilB(xb)	yia=log10(xa)	yib=log10(xb)	|yia-yib|	|yia-yib|2
1	30	10	30	1	1,477	*	*
2	300	110	182	2,041	2,260	0,219	0,048
3	300	410	620	2,613	2,792	0,180	0,032
4	600	640	330	2,806	2,519	0,288	0,083
5	600	690	570	2,839	2,756	0,083	0,007
6	600	780	640	2,892	2,806	0,086	0,007
7	600	620	1300	2,792	3,114	0,322	0,103
8	600	870	1500	2,940	3,176	0,237	0,056
9	6000	8600	6400	3,934	3,806	0,128	0,016
10	6000	16000	5000	4,204	3,699	0,505	0,255
11	6000	>15000	13400	>4,176	4,127	*	*
12	30000	20000	32000	4,301	4,505	0,204	0,042
*tidak digunakan karena < LOQ atau > upper limit

∑|yia-yib|2=	0,650
∑|yia-yib|2/2p=	0,032
sIR=√(∑|yia-yib|2/2p)=	0,180

Data interlaboratory reproducibility (s_R) dari ISO 21528-2 :

sR	low level	intermediate level	high level	mean
pasteurized egg	0,32	0,50	0,48	0,43
minced meat	0,28	0,36	0,57	0,40
animal feed	0,18	0,17	0,20	0,18
pasteurized milk	0,24	0,18	0,19	0,20
tiramisu	0,22	0,28	0,13	0,21
			lowest sR	0,18

Perbandingan S_R dari data metode dan S_RI dari data verifikasi

Persyaratan : s_IR ≤ s_R

sIR =	sR =
0,18	0,18
kesimpulan : Diterima

Disimpulkan verifikasi intralaboratory reproducibility dapat diterima

Perhitungan Estimated Bias

Bias adalah pengukuran kesalahan atau selisish sistematik antara nilai benar dengan nilai hasil rata-rata replikasi pengukuran (ISO 16140-1, 2016, hal. 2). Penambahan istilah estimated pada perhitungan ini disebabkan nilai bias yang diperoleh tidak begitu akurat karena jumlah pengukuran sampel (nilai benar) yang kecil.

Tahap-tahap perhitungan estimated bias adalah:

• Dipilih item pangan minimal 1.
• Sampel item pangan ditambah dengan kontaminasi buatan pada tiga tingkat (level) yang berbeda, dengan setiap tingkat kontaminasi dimasukkan pada dua pengencer pertama (initial suspension).
• Dilakukan analisis sesuai metode yang diacu secara paralel pada item pangan dan pengencer pertama tersebut.
• Porsi uji tanpa penambahan kontaminasi diuji secara duplikat untuk mengetahui jumlah mikroorganisme latar belakang.

Berikut bagan untuk preparasi kontaminasi buatan dan inokulasiannya ke dalam sampel.

Gambar 2. Bagan penentuan konsentrasi mula-mula (initial concentration) dari kultur bakteri untuk penentuan estimated bias. Diadaptasi dari “ISO 16140-3: 2017. Microbiology of the food chain — Method validation — Part 3: Protocol for the verification of reference and validated alternative methods implemented in a single laboratory”, oleh ISO, 2017, hal. 53.

Gambar 3. Bagan penentuan suspensi inokulum mikrorganisme mula-mula (inoculum suspension) dari kultur bakteri untuk penentuan estimated bias. Diadaptasi dari “ISO 16140-3: 2017. Microbiology of the food chain — Method validation — Part 3: Protocol for the verification of reference and validated alternative methods implemented in a single laboratory”, oleh ISO, 2017, hal. 54.

Gambar 4. Bagan inokulasi dan analisis suspensi inokulum (inoculum suspension) ke dalam item pangan untuk penentuan estimated bias. Angka merah adalah simulasi perhitungan dalam bagan. Diadaptasi dari “ISO 16140-3: 2017. Microbiology of the food chain — Method validation — Part 3: Protocol for the verification of reference and validated alternative methods implemented in a single laboratory”, oleh ISO, 2017, hal. 55.

Diinkubasi semalam pada suhu yang sesuai dari bagan diatas adalah mengacu kepada persyaratan media pertumbuhan dan suhu inkubasi yang cocok dengan mikrorganisme target berdasarkan kriteria Tabel 7.3 yaitu persyaratan kinerja dan mikroorganisme uji yang digunakan pada berbagai jenis media pada pengujian mikrobiologi pangan sesuai ISO 11133: 2014.

Data yang didapatkan hasil A (x_a) dan B (x_b) lalu di hitung dengan rumus :

y_a = log 10 (x_a)

y_b = log 10 (x_b)

y_a = (y_a,1+ y_a,2)/2

y_b = (y_b,1+ y_b,2)/2

eB = y_a-y_b

keterangan :

eB : estimated bias

y_a : log 10 (x_a)

y_a : rata-rata y_a dari satu sampel dengan porsi uji yang berbeda

x_a : hasil dari sampel item pangan ditambah kontaminasi buatan

y_b : log 10 (x_b)

y_b : rata-rata y_b dari satu sampel dengan porsi uji yang berbeda

x_b : hasil dari sampel inoculum suspension tanpa item pangan

Jika eB ≤ 0,5 (log10 CFU/g) maka estimated bias dapat diterima untuk setiap konsentrasi.

Jika persyaratan diatas tidak dapat dicapai maka sebaiknya dilakukan identifikasi kesalahan karena faktor analis, peralatan, bahan, aplikasi prosedur (kesalahan inokulum), dll. Bila masalah telah diidentifikasi maka pengujian verifikasi ini dapat dilakukan ulang.

Contoh perhitungan :

Metode yang diverifikasi :

ISO 21528-2 Microbiology of the food chain – Horizontal method for the detection and enumeration of Enterobacteriaceae – Part 2: Colony-count technique

Kategori kisaran kontaminasi : 100-10000 CFU/g

Kontaminasi buatan : E.coli

Kategori verifikasi : boiled pasta

Pemberian kontaminasi buatan :

spl.	porsi uji	Kontaminasi (CFU/g)
1	1	100
	2	100
2	1	5000
	2	5000
3	1	10000
	2	10000

Perhitungan estimated bias :

spl.	porsi uji	Hasil (CFU/g)		Hasil (log10 CFU/g)		Mean (log10 CFU/g)
		xa	xb	ya=log10 (xa)	yb=log10 (xb)	ya	yb
1	1	74	140	1,869	2,146	2,05	2,18
	2	170	160	2,230	2,204
2	1	5300	3800	3,724	3,580	3,68	3,61
	2	4300	4400	3,633	3,643
3	1	8500	17000	3,929	4,230	3,99	4,29
	2	11000	22000	4,041	4,342

Kesimpulan keberterimaan :

spl.	porsi uji	eB=ya-yb (log10CFU/g)	Syarat (log10CFU/g)	kesimpulan
					1	1	-0,13	≤ 0,5	Diterima
2
2	1	0,07	≤ 0,5	Diterima
	2
3	1	-0,30	≤ 0,5	Diterima
	2

Indra Pradhika, 2019

Referensi

ISO 16140-1: 2016. Microbiology of the food chain — Method validation — Part 1: Vocabulary (2016).

ISO 16140-3: 2017. Microbiology of the food chain — Method validation — Part 3: Protocol for the verification of reference and validated alternative methods implemented in a single laboratory (2017).

ISO 21528-2: 2017 Microbiology of the food chain – Horizontal method for the detection and enumeration of Enterobacteriaceae – Part 2: Colony-count technique (2017).