Prosedur Perhitungan Verifikasi Metode Mikrobiologi Kualitataif
Karakteristik kinerja yang disyaratkan dan harus dihitung untuk verifikasi metode mikrobiologi kualitatif pada matriks pangan dan pakan adalah sebagai berikut. Pembagian dan persyaratan karakteristik kinerja verifikasi mikrobiologi dapat dibaca pada pembahasan Karakteristik Kinerja Verifikasi Metode Mikrobiologi.
Tabel 1. Karakteristik kinerja yang disyaratkan untuk verifikasi. Diadaptasi dari “ISO 16140-3: 2017. Microbiology of the food chain — Method validation — Part 3: Protocol for the verification of reference and validated alternative methods implemented in a single laboratory”, oleh ISO, 2017, hal: 15.
|
Metode |
Parameter |
Verifikasi implementasi |
Verifikasi item |
|
Kualiatif |
Estimated LOD (eLOD50) |
√ |
√ |
Perhitungan Estimated LOD50
LOD50 adalah tingkat pendeteksian yang menghasilkan data positif dengan probabilitas 50%. Istilah LOD (Level of Detection) pada bahasan ini berbeda dengan LOD (Limit of Detection) yang digunakan secara umum (ISO 16140-1, 2016, hal. 5).
Tahap-tahap perhitungan estimated LOD50 adalah:
- Disiapkan kultur mikroorganisme target untuk diinokulasikan ke item pangan.
- Disiapkan minimum 8 porsi uji dari item pangan yang sama. Dipilih item pangan yang tidak secara alami terkontaminasi oleh mikrorganisme target.
- Diinokulasikan 6 porsi uji: 2 pada high level, 2 pada intermediate level dan 2 pada low level. Selain itu 2 porsi uji tidak diinokulasikan dengan mikrorganisme target.
- Jika konsentrasi mikroorganisme target tidak diketahui maka porsi uji dapat ditambah dengan penambahan pengenceran untuk memastikan level target termasuk ke dalam verifikasi. [setiap pengenceran diinokulasikan ke dalam dua porsi uji (1 ml dan 0,5 ml) sehingga total sebanyak 12 porsi uji (4 high, 4 intermediate, 4 low) dan 2 blangko]. Namun hanya tiga level yang relevan digunakan untuk perhitungan.
- Disarankan jika LOD50 tidak diketahui maka konsentrasi pada high level adalah 10 CFU/porsi uji, intermediate level adalah adalah 5 CFU/porsi uji, dan low level adalah 1 CFU/porsi uji.
- Penentuan konsentrasi inokulum kontaminasi dengan menanam inokulum high level pada media non-selektif. Disaat yang sama porsi uji diinokulasi dengan inokulum tersebut. Level kontaminasi selain pada high level ditentukan dengan mengencerkan inokulum high level yang sudah diketahui.
- Dilakukan analisis sesuai metode yang diacu. Prosedur metode harus dilakukan sampai akhir, termasuk uji konfirmasi jika ada. Uji konfirmasi ini dilakukan untuk setiap porsi uji, tetapi pengujian konfirmasi koloni (bila positif) dapat dikurangi menjadi hanya satu koloni saja.
- eLOD50 dihitung berdasarkan hasil positif negatif dari porsi uji tersebut sesuai tabel berikut.
Tabel 2. Tabel penentuan eLOD50 berasarkan kombinasi data positif negatif dari 8 porsi uji pada level inokulum yang berbeda. Diadaptasi dari “ISO 16140-3: 2017. Microbiology of the food chain — Method validation — Part 3: Protocol for the verification of reference and validated alternative methods implemented in a single laboratory”, oleh ISO, 2017, hal. 18.
|
innoculation level |
blank |
kombinasi hasil positif |
eLOD50 (CFU/ porsi uji) . LLI* |
||||||
|
high |
intermediate |
low |
|||||||
|
10.LOD50/ porsi uji |
5.LOD50/ porsi uji |
1.LOD50/ porsi uji |
|||||||
|
positif |
total |
positif |
total |
positif |
total |
psitif |
total |
||
|
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
0 |
2 |
222 |
<1 |
|
2 |
2 |
2 |
2 |
1 |
2 |
0 |
2 |
221 |
1 |
|
2 |
2 |
2 |
2 |
0 |
2 |
0 |
2 |
220 |
2 |
|
2 |
2 |
1 |
2 |
2 |
2 |
0 |
2 |
212 |
2 |
|
2 |
2 |
1 |
2 |
1 |
2 |
0 |
2 |
211 |
3 |
|
2 |
2 |
1 |
2 |
0 |
2 |
0 |
2 |
210 |
4 |
|
2 |
2 |
0 |
2 |
2 |
2 |
0 |
2 |
202 |
** |
|
2 |
2 |
0 |
2 |
1 |
2 |
0 |
2 |
201 |
5 |
|
2 |
2 |
0 |
2 |
0 |
2 |
0 |
2 |
200 |
8 |
|
*LLI : low level inoculation |
|||||||||
|
** hasil yang tidak dipercaya |
|||||||||
- Syarat data pada kolom high innoculation level (10.LOD50) harus menghasilkan data positif semua (2), selain itu pada kolom blank harus menghasilkan data negatif (0) semua, jika tidak maka pengujian diulang pada semua level.
- eLOD50 yang diperoleh dari tabel lalu dibandingkan dengan LOD50 dari data validasi metode referensi. Jika LOD yang diperoleh ≤3.LOD50 data validasi maka nilai perhitungan eLOD50 dapat diterima.
- Jika LOD50 dari data validasi metode referensi tidak dipublikasikan, maka persyaratan keberterimaannya menjadi ≤3 CFU/porsi uji. Nilai ini diturunkan dari nilai LOD50 secara teoretis yang dapat diterima yaitu 1 CFU/porsi uji ditambah margin 3 kali lebih tinggi.
- eLOD50 yang dihasilkan dari validasi ini dapat dinyatakan sebagai CFU/ml atau CFU/porsi uji. Jika LOD50 hasil validasi dinyatakan sebagai CFU/ml atau CFU/g maka nilai awal tersebut harus dibagi dengan ukuran porsi uji. Misalnya LOD50 dari 0,1 CFU/g akan menghasilkan LOD50 sebesar 2,5 bila ukuran porsi ujinya 25 g.
Berikut bagan untuk preparasi kontaminasi buatan dan inokulasiannya ke dalam sampel.
Gambar 1. Bagan penentuan konsentrasi mula-mula (initial concentration) dari kultur bakteri untuk penentuan estimated bias. Diadaptasi dari “ISO 16140-3: 2017. Microbiology of the food chain — Method validation — Part 3: Protocol for the verification of reference and validated alternative methods implemented in a single laboratory”, oleh ISO, 2017, hal. 53.
Diinkubasi semalam pada suhu yang sesuai dari bagan diatas adalah mengacu kepada persyaratan media pertumbuhan dan suhu inkubasi yang cocok dengan mikrorganisme target berdasarkan kriteria persyaratan kinerja dan mikroorganisme uji yang digunakan pada berbagai jenis media pada pengujian mikrobiologi pangan sesuai ISO 11133: 2014.
Gambar 2. Bagan inokulasi dan analisis suspensi inokulum (inoculum suspension) ke dalam porsi uji item pangan untuk penentuan eLOD50 (Bagian 1). Diadaptasi dari “ISO 16140-3: 2017. Microbiology of the food chain — Method validation — Part 3: Protocol for the verification of reference and validated alternative methods implemented in a single laboratory”, oleh ISO, 2017, hal. 50.
Gambar 3. Bagan inokulasi dan analisis suspensi inokulum (inoculum suspension) ke dalam porsi uji item pangan untuk penentuan eLOD50 (Bagian 2). Diadaptasi dari “ISO 16140-3: 2017. Microbiology of the food chain — Method validation — Part 3: Protocol for the verification of reference and validated alternative methods implemented in a single laboratory”, oleh ISO, 2017, hal. 50.
Contoh perhitungan :
Metode yang diverifikasi :
ISO 6579-1: 2017 Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection, enumeration and serotyping of Salmonella — Part 1: Detection of Salmonella spp.
LOD50 metode : 2,5 CFU/porsi uji
Level kontaminasi : 25 CFU/porsi uji, 12,5 CFU/porsi uji 2,5 CFU/porsi uji
Kontaminasi buatan : Salmonella typhii
Kategori verifikasi : raw meat
Pemberian inokulum :
|
innoculation level |
blank |
kombinasi hasil positif |
eLOD50 (CFU/ porsi uji) |
||||||
|
high |
intermediate |
low |
|||||||
|
25 CFU/ porsi uji |
12,5 CFU/ porsi uji |
2,5 CFU/ porsi uji |
|||||||
|
+ |
tot |
+ |
tot |
+ |
tot |
+ |
tot |
||
|
2 |
2 |
2 |
2 |
1 |
2 |
0 |
2 |
221 |
2,5 |
|
*LLI : low level inoculation = 2,5 CFU /porsi uji |
|||||||||
Jika eLOD50 yang diperoleh ≤3.LOD50 data validasi maka nilai perhitungan eLOD50 dapat diterima.
eLOD50 perhitungan
= 2,5 CFU/porsi uji
3.LOD50 data validasi
= 3 x 2,5 CFU/porsi uji
= 7,5 CFU/porsi uji
syarat : ≤ 7,5 CFU/porsi uji
maka eLOD50 perhitungan diterima.
Misalnya untuk soal yang sama didapatkan hasil lain seperti berikut.
|
innoculation level |
blank |
kombinasi hasil positif |
eLOD50 (CFU/ porsi uji) |
||||||
|
high |
intermediate |
low |
|||||||
|
25 CFU/ porsi uji |
12,5 CFU/ porsi uji |
2,5 CFU/ porsi uji |
|||||||
|
+ |
tot |
+ |
tot |
+ |
tot |
+ |
tot |
||
|
2 |
2 |
1 |
2 |
0 |
2 |
0 |
2 |
210 |
10 |
|
*LLI : low level inoculation = 2,5 CFU /porsi uji |
|||||||||
Jika eLOD50 yang diperoleh ≤3.LOD50 data validasi maka nilai perhitungan eLOD50 dapat diterima.
eLOD50 perhitungan
= 10 CFU/porsi uji
3.LOD50 data validasi
= 3 x 2,5 CFU/porsi uji
= 7,5 CFU/porsi uji
syarat : ≤ 7,5 CFU/porsi uji
maka eLOD50 perhitungan tidak diterima.
Indra Pradhika, 2019
Referensi
ISO 16140-1: 2016. Microbiology of the food chain — Method validation — Part 1: Vocabulary
ISO 16140-3: 2017. Microbiology of the food chain — Method validation — Part 3: Protocol for the verification of reference and validated alternative methods implemented in a single laboratory. (2017).
ISO 6579-1: 2017 Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection, enumeration and serotyping of Salmonella — Part 1: Detection of Salmonella spp
Kadang kala standar internal dengan konsentrasi yang sudah diketahui ditambahkan langsung pada sampel dengan tujuan kuantifikasi. Jumlah analit yang ada kemudian ditentukan relatif terhadap standar internal sebagai pengkalibrasi. Standar internal yang ideal adalah analit yang diperkaya isotop sehingga dapat dilakukan metode pengenceran isotop .
Pada prinsipnya memang mirip seperti yang dijelaskan ibu, yaitu stadar internal (koleksi kultur) yang sudah diketahui jumlahnya ditambahkan langsung. Namun untuk bidang mikrobiologi pangan setahu saya analit (mikroorganisme) tidak ada yang ditambahi isotop. Mungkin di bidang biotek akan diperlakukan seperti itu.
Terima kasih atas share ilmunya sangat bermanfaat. Ada yang ingin saya tanyakan, setelah LOD50 nya sudah diterima, apakah setelah itu lanjut ke uji selanjutnya untuk menentukan sensifitas dan spesifitas dan ini mengacu pada ISO 16140-2?
Jika khusus untuk metode kualitatif dan menurut ISO ini, jawabannya tidak (cukup LOD 50 saja). Namun lain hal jika mengacu ke referensi lain, seperti SAC-SINGLASS, NATA atau lainnya, ada yang menyebutkan memakai sensitifitas dan spesifitas.
Permisi~
Item pangan yang digunakan kan harus tidak secara alami mengandung bakteri target. Berarti apakah item pangan tersebut tidak harus steril, yang penting tidak secara alami mengandung bakteri target?Terimakasih banyak sebelumnya~