1. Pengertian Ketidakpastian Pengukuran

Hasil akhir setiap pengukuran suatu alat atau pengukuran dari suatu metode mikrobiologi kuantitatif adalah menyajikan data pengukuran misalnya volume yang diambil oleh pipet dalam mL atau jumlah konsentrasi mikrorganisme dalam satuan CFU/g. Namun hasil tersebut adalah suatu taksiran dari nilai besaran ukur. Nilai taksiran membutuhkan suatu nilai kisaran. Tidak mungkin nilai tersebut langsung dinyatakan sebagai nilai benar. Oleh karena nilai tersebut hanya taksiran, maka setiap hasil pengukuran memiliki ketidakpastian dan selalu mengandung kesalahan. Maka dari itu, diperlukan suatu perhitungan untuk mengukur ketidakpastian dan kesalahan tersebut.

Nilai benar besaran ukur dan kesalahan pengukuran merupakan nilai yang tidak dapat diketahui. Hasil pengukuran hanya dikatakan lengkap jika disertai dengan taksiran rentang dimana nilai benar dari besaran ukur tersebut diyakini berada didalamnya. Parameter yang menyatakan suatu rentang dimana nilai benar dari besaran ukur tersebut diyakini berada di dalamnya dengan tingkat kepercayaan tertentu disebut dengan ketidakpastian pengukuran. Ketidakpastian ini dapat dihitung berdasarkan hasil pengamatan terhadap perilaku besaran ukur selama proses pengukuran dilakukan.

Terminologi ‘pengukuran ketidakpastian’ digunakan untuk menunjukkan kurangnya accuracy (trueness dan precision) yang dapat dihubungkan dengan hasil analisis. Dalam konteks mikrobiologi kuantitatif, pengukuran ini menyediakan sebuah indikasi derajat kepercayaan yang dapat ditempatkan pada hasil perkiraan jumlah mikroorganisme pada pangan atau bahan lainnya (ISO 19036: 2019, hal. vi).

Menurut ISO 19036: 2019 ketidakpastian pengukuran adalah suatu parameter yang berasosiasi dengan hasil pengukuran (measurement), yang menyatakan sebaran nilai yang secara wajar dapat dikaitkan kepada besaran ukur (measurand) (2019, hal.3).

Jika taksiran nilai besaran ukur dinyatakan x, ketidakpastian pengukuran adalah dinyatakan U, maka nilai dari besaran ukur tersebut X diyakini dalam rentang persamaan berikut:

x-U ≤ X ≤ x+U

Beberapa pengertian istilah yang harus dipahami adalah :

Standard uncertainty / Ketidakpastian standar (u) adalah ketidakpastian hasil pengukuran yang diekspresikan sebagai standar deviasi (ISO 19036:2019, hal.3).

Combined standard uncertainty / Ketidakpastian standar kombinasi (u_c(y)) ketidakpastian standar dari hasil sebuah pengukuran ketika hasilnya diperoleh dari nilai sejumlah kuantitas (ketidakpastian standar) lainnya, yang sama dengan akar kuadrat dari jumlah ketidakpastian standar tersebut (ISO 19036:2019, hal.3).

Expanded uncertainty / Ketidakpastian dipeluas (U) adalah angka yang menggambarkan rentang hasil dari pengukuran yang mungkin melingkupi sebagian besar sebaran nilai berada, yang secara wajar dikaitkan dengan besaran ukur (ISO 19036:2019, hal.3).

Coverage factor / Faktor cakupan (k) adalah faktor numerik yang digunakan sebagai pengali dari ketidakpastian standar kombinasi dalam rangka untuk memperoleh ketidakpastian diperluas. Faktor cakupan, k, umumnya berada dalam kisaran 2 sampai 3 (ISO 19036:2019, hal. 3).

Menurut KAN G-01 (2011, hal. 10) terdapat dua komponen kesalahan pengukuran, yaitu kesalahan acak dan kesalahan sistematik. Kesalahan acak (random error) adalah hasil satu pengukuran dikurangi dengan nilai rata-rata dari sejumlah besar pengukuran terhadap besaran ukur yang sama dalam kondisi pengukuran tertentu. Kesalahan acak timbul dari besaran berpengaruh tidak terduga. Nilai tersebut tidak dapat dikoreksi karena bervariasi dari satu pengukuran ke pengukuran lainnya. Kesalahan acak dari pengukuran tersebut dapat dihitung dari nilai reprodusibilitasnya. Sedangkan kesalahan sistematik (systematic error) adalah nilai rata-rata dari sejumlah besar pengukuran berulang terhadap besaran ukur yang sama dalam kondisi pengukuran tertentu dikurangi nilai benar (true value) besaran ukur tersebut. Kesalahan sistematik timbul dari besaran berpengaruh yang dapat diduga berdasarkan model besaran ukur. Taksiran nilai benar diberikan oleh nilai dalam sertifikat kalibrasi alat ukur atau standar pengukuran. Taksiran kesalahan ini dapat dihitung dari pengaruh besaran yang dapat dikenali selama proses pengukuran sehingga taksiran kesalahan sistemik ini dapat dikoreksi dengan nilai koreksi atau faktor koreksi.

.

Gambar 1. Ilustrasi pengaruh kesalahan (e) acak (atas) dan sistematik (bawah) terhadap nilai benar (X).

Kesalahan sitematik juga dapat disebut bias. Menurut ISO 19036 (2019) bias adalah perbedaan antara hasil uji yang diharapkan dengan nilai referensi yang dapat diterima. Mungkin terdapat lebih dari satu kesalahan sitematik yang berpengaruh terhadap nilai bias tersebut. Secara umum bias diabaikan dalam perhitungan ketidakpastian mikrobiologi pangan karena prosedur analisisnya secara langsung menentukan hasil pengukuran, misalnya jumlah CFU/g. Jadi hal ini tidak mungkin didapatkan nilai benar pengukuran tersebut, meskipun telah menggunakan CRM (hal.3).

2. Sudut Pandang Mikrobiologi dalam Pendekatan Estimasi Ketidakpastian

Pada umumnya pengukuran ketidakpastian, baik kimia, fiska ataupun lainnya mengacu kepada ISO Guide 98-3 (atau yang dikenal dengan GUM (Guide Uncertainty Measurements)) dengan membuat model pengukuran kuantitatif ketidakpastian. Dalam sudut pandang analisis mikrobiologi, khususnya pangan, tidak dimungkinkan untuk membuat model pengukuran kuantitatif ketidakpastian ini. Hal ini dikarenakan tidak dimungkinkannya menghitung secara akurat kontribusi dari setiap kuantitas yang dimasukkan (setiap sumber ketidakpastian), sebab:

• analit adalah organisme hidup, dimana tingkat fisiologinya dapat bermacam-macam.
• target analit dapat berupa strain yang berbeda, spesies yang berbeda atau genus yang berbeda.
• banyak kuantitas yang dimasukkan sulit untuk diketahui, misalnya tingkat fisiologis analit.
• untuk beberapa kuantitas yang dimasukkan, seperti suhu dan Aw, efeknya terhadap analit yang diukur tidak dapat dideskripsikan secara kuantitatif dengan presisi yang cukup.

Oleh karena itu, dalam mikrobiologi menggunakan pendekatan top-down atau disebut juga global approach to MU dengan mencari standard deviation reproducibility-nya (ISO 19036: 2019, hal. vi).

Selain alasan diatas, pengukuran mikrobiologis juga tergantung kepada perhitungan atau pendeteksian organisme dalam jumlah cukup kecil yang kurang lebih tersebar secara random karena keberagaman antar ulangan yang sesuai dengan ketidakpastian persebarannya.

Untuk metode hitungan cawan unsur ketidakpastian dari poisson distribution dan juga unsur ketidakpastian yang berhubungan dengan uji konfirmasi juga perlu ditentukan dan ditambahkan. Penambahan unsur ketidakpastian juga terjadi pada metode MPN, yaitu penambahan unsur persebarannya dan estimasi dari teori statistik.

3. Perbandingan dengan Estimasi Ketidakpastian Kimia

Pada mulanya konsep ketidakpastian pengukuran diperkenalkan terlebih dahulu kepada laboratorium kimia, tetapi ketidakpastian ini tidak secara baik diberikan kepada mikrobiologi karena asumsi yang telah ada terhadap homogenitas sampel mikrobiologi yang tidak merata. Ketidakpastian pengukuran pada kimia biasanya dihasilkan dari data replikasi porsi uji. Namun replikasi di dalam mikrobiologi tidak sama dengan kimia, replikasi ini umumnya sangat berbeda antar porsi uji yang disebabkan oleh homogenitas sampel, keadaan fisiologis setiap analit (mikroorganisme), dll.

Di dalam laboratorium kimia berlaku nilai benar yang ada kemungkinan besar jatuh pada rentang ketidakpastian yang diukur jika semua kesalahan telah dimasukkan ke dalam perhitungan ketidakpastian tersebut. Dalam perhitungannya, setiap unsur ketidakpastian dicari dengan menghitung presisi untuk setiap sumber ketidakpastian dari setiap tahap metode. Misalnya ketidakpastian pengukuran analisis moisture ditelusuri presisi timbangan dengan mengukur keberulangan pada saat kalibrasi, atau presisi oven yang digunakan. Dalam bidang kimia, variasi dapat diperkirakan kecil karena analit dapat diasumsikan sangat tersebar homogen di sampel. Variasi acak tersebarnya molekul analit dalam sampel dimungkinkan berada dibawah LOD.

Tidak semua sel mikroorganisme, bahkan dalam tingkat spesies, berperilaku sama dalam tiap sampel. Hal ini mungkin berkaitan dengan perbedaan tahap dalam pertumbuhannya, perbedaan respon stress lingkungan yang dihadapi, perbedaan aktivitas metabolismenya, sehingga alasan-alasan inilah yang menyebabkan besarnya variasi kemampuan setiap sel untuk tumbuh saat di permukaan media pertumbuhan. Bertolak belakang dengan mikroorganisme, molekul analit dapat diasumsikan sangat merata dan dalam kondisi yang sama saat dianalisis.

Selain itu perlu dicatat juga bahwa sampel mikrobiologi hanya dapat dianalisis sekali, sampel retain yang telah disimpan setelah analisis selesai tidak dapat disamakan dengan sampel permulaan yang dianalisis tersebut. Maka dari itu, nilai benar suatu sampel hanya berlaku pada saat analisis pertama dan tidak dapat digunakan untuk analisis seterusnya.

4. Sumber Komponen Ketidakpastian

Untuk memudahkan pemahaman mengenai sumber ketidakpastian, dapat dilihat bagan sumber-sumber ketidakpastian berikut. Garis tega menunjukkan tahap-tahap alur analisis, sedangkan garis putus-putus adalah beberapa sumber faktor yang berpengaruh terhadap ketidakpastian pengukuran mikrobiologi.

Gambar 2. Sumber-sumber utama ketidakpastian dalam mikrobiologi. Diadaptasi dari “ISO 19036: 2019. Microbiology of the food chain – Estimation of Measurement Uncertainty for Quantitative Determination”, oleh ISO, 2019, hal. 7.

5. Jenis-jenis Ketidakpastian

Berdasarkan sumber-sumber ketidakpastian tersebut unsur ketidakpastian dapat dikelompokkan menjadi beberapa jenis, yaitu :

5.1. Ketidakpastian Teknis

Technical uncertainty / ketidakpastian teknis adalah ketidakpastian yang dihasilkan dari variabilitas operasional yang dikaitkan dengan tahap-tahap teknis dari prosedur analisis, misalnya pengambilan, pencampuran dan pengenceran porsi uji, termasuk juga variabilitas inkubasi dan media (ISO 19036:2019, hal. 4). Ketidakpastian teknis ini adalah karakteristik tersendiri dari suatu metode, sehingga ketidakpastian teknis pada metode tertentu tidak dapat diaplikasikan terhadap metode lain yang berbeda.

Beberapa sumber ketidakpastian teknis adalah:

• Pengambilan porsi uji dari sampel
• Preparasi pengenceran pertama
• Pengenceran bertingkat
• Inokulasi
• Inkubasi
• Perhitungan koloni atau pendeteksian pertumbuhan (MPN)
• Uji konfirmasi (jika ada)

5.2. Ketidakpastian Matriks

Matrix uncertainty / ketidakpastian matriks adalah ketidakpastian yang dihasilkan dari banyaknya porsi uji yang tidak merepresentasikan sampel keseluruhan (ISO 19036:2019, hal. 4).

Ketidakpastian ini dapat timbul dari ketidakhomogenan sampel yang dapat menghasilkan angka reproducibility yang buruk. Hal ini terjadi terutama pada matriks sampel padat. Ketidakpastian matriks ini ditentukan untuk setiap jenis matriks, berbeda matriks maka memiliki nilai ketidakpastian yang berbeda juga.

Hasil uji suatu metode dapat dipengaruhi oleh jenis matriks sampel dan distribusi mikroorganisme di dalamnya. Ketidakpastian matriks ini hanya mengacu kepada efek persebaran mikroorganisme di dalam matriks sampel, misalnya nilai keberagaman hasil akhir antar porsi uji dari sampel yang sama. Ketidakpastian matriks tentunya tidak sama dengan ketidakpastian sampling. Ketidakpastian matriks ini dapat berdiri sendiri dan terlepas dari metode yang dianut. Nilai ketidakpastian suatu matriks dapat dipakai pada semua metode yang berbeda asalkan matriksnya sama. Namun perlu dipertimbangkan untuk mencari nilai ketidakpastian matriks yang sama jenisnya jika memakai analit yang berbeda (jenis mikroorganisme yang berbeda) karena dapat dimungkinkan distribusinya juga berbeda.

Jika material sampel sangat homogen, seperti cairan yang tercampur dengan baik (susu, air mineral, dll.) maka ketidakpastian matriks dimungkinkan sangat kecil. Sebaliknya jika material sampel memiliki kontaminasi mikroorganisme yang tidak merata atau berkelompok (misalnya, daging, sosis dll.) maka ketidakpastian matriks dimungkinkan tinggi.

Gambar 3. Distribusi hipotetikal keberadaan analit pada sampel permukaan. Titik hitam menggambarkan tempat dimana analit berada. Kiri : tersebar secara acak, kanan : tersebar berkelompok (adanya clumps atau microcolonies). Diadaptasi dari “ISO 19036: 2019. Microbiology of the food chain – Estimation of Measurement Uncertainty for Quantitative Determination”, oleh ISO, 2019, hal.30

Gambar 4. Distribusi hipotetikal keberadaan analit pada sampel padat seperti daging atau sayuran. Kotak hitam menggambarkan transek dimana analit berada. Diadaptasi dari “ISO 19036: 2019. Microbiology of the food chain – Estimation of Measurement Uncertainty for Quantitative Determination”, oleh ISO, 2019, hal.31.

5.3. Ketidakpastian Distribusional

Distributional uncertainty / ketidakpastian distribusional adalah ketidakpastian yang dihasilkan dari keberagaman (variability) intrinsik dari sebaran mikroorganisme dalam sampel, pengenceran pertama dan pengenceran berikutnya (ISO 19036:2019, hal. 4).

Ketidakpastian distribusional ini terbagi menjadi beberapa jenis berdasarkan metode mikrobiologi yang digunakan, yaitu.

Metode hitungan cawan :

• ketidakpastian Poisson
• ketidakpastian konfirmasi

Metode MPN :

• ketidakpastian MPN.

Berlanjut ke Bagian 2

Indra Pradhika, 2019