6. Penentuan Estimasi Ketidakpastian Pengukuran

Perhitungan ketidakpastian pengukuran pada bagian ini tidak dapat mencakup kontribusi ketidakpastian dari efek sitematik (bias). Hal ini disebabkan umumnya nilai benar (assigned value atau reference value) dari CRM tidak tersedia untuk bidang mikrobiologi kuantitatif ini, sehingga ketidakpastian bias menjadi sulit dilakukan (ISO 19036: 2019, hal. 5).

Notasi yang perlu diketahui dalam perhitungan ketidakpastian adalah :

ΣC : jumlah total koloni untuk hitungan cawan

n_p : jumlah koloni presumptif yang diuji (pada uji konfirmasi)

n_c : jumlah koloni terkonfirmasi (pada uji konfirmasi)

s_R : standar deviasi reproducibility

s_IR : standar deviasi intralaboratory reproducibility

s_r : deviasi standar repeatability

u : ketidakpastian standar

u_distrib : ketidakpastian standar distribusional

u_tech : ketidakpastian standar teknikal

u_conf : ketidakpastian standar uji konfirmasi

u_matrix : ketidakpastian standar matriks

u_MPN : ketidakpastian standar MPN

u_Poisson : ketidakpastian standar Poisson

u_c(y) : ketidakpastian dikombinasi

k : faktor cakupan

U : ketidakpastian diperluas

6.1. Penentuan Ketidakpastian Teknis

Ketidakpastian teknis (u_Tech) diperoleh dari standar deviasi reproducibility (s_R) dari hasil akhir proses pengukuran. Konsep dalam reproducibility adalah keberulangan analisis dengan kondisi yang berbeda dengan metode yang sama.

U_tech = s_R

Ketidakpastian teknis dapat dihitung dari beberapa cara yaitu :

• Dihasilkan dari reproducibility dalam laboratorium (intralaboratory) (s_IR).
• Dihasilkan dari reproducibility yang diturunkan dari hasil validasi metode antar laboratorium (interlaboratory) (s_R,val).

6.1.1. Penentuan Ketidakpastian Teknis Intralaboratory Reproducibility

Perhitungan ini dapat dilakukan dengan dilakukan dengan menguji sampel yang dibagi menjadi dua setelah dihomogenisasi (porsi A dan porsi B) kemudian dianalisis dengan kondisi yang berbeda (waktu, alat, batch media dan teknisi yang berbeda) sesuai bagan pada gambar dibawah ini dengan minimal 10 kali ulangan (ISO 19036: 2019, hal. 10). Namun ALACC Guide (2007) menyebutkan bahwa perhitungan ketidakpastian lebih dapat dipercaya jika menggunakan minimum 30 pengamatan atau pengulangan (hal. 9).

.

Gambar 5. Bagan kerja penentuan intralaboratory reproducibility. Diadaptasi dari “ISO 19036: 2019. Microbiology of the food chain – Estimation of Measurement Uncertainty for Quantitative Determination”, oleh ISO, 2019, hal. 9.

Tidak diperlukan untuk menentukan ketidakpastian teknis dengan matriks yang berbeda (cukup dianalisis satu jenis matriks sampel), karena intralaboratory reproducibility ini dirancang untuk mengecualikan pengaruh dari heterogenitas matriks sampel yang berbeda.

Menurut ISO 16140-2: 2016 (hal. 46) terdapat beberapa opsi mengenai penambahan analit ke dalam sampel dalam prosedur penambahan kontaminasi buatan, yaitu.

• Pilihan 1 sampel ditambah dengan kontaminasi alami.
• Pilihan 2 sampel ditambah dengan kontaminasi campuran
• Pilihan 3 sampel ditambah dengan kontaminasi buatan.
• Pilihan 4 sampel ditambah dengan CRM.

Berikut tahap-tahap perhitungannya :

Data yang didapatkan hasil A (x_a) dan B (x_b) lalu di hitung dengan rumus :

s_IR = √(∑(y_ia – y_ib)² /2n)

keterangan :

s_IR : intralaboratory reproducibility

i : indeks sampel laboratorium, i = 1 sampai n (n ≥10)

n : jumlah sampel

y_ia – y_{ib :} selisih log10 (x_a) & log10 (x_b), y_a= log10 (x_a), y_b= log10 (x_b)

Contoh perhitungan :

	porsi uji A					porsi uji B
n	d1	C1	d1	C1	ΣCa	d1	C1	d1	C1	ΣCb
1	3	102	4	8	110	3	59	4	4	63
2	5	61	6	6	67	5	66	6	8	74
3	4	168	5	18	186	4	86	5	7	93
4	5	266	6	25	291	5	140	6	16	156
5	6	45	7	5	50	5	129	6	15	144
6	4	129	5	12	141	4	117	5	10	127
7	2	92	3	8	100	2	131	3	13	144
8	3	139	4	13	152	3	143	4	15	158
9	1	49	2	5	54	1	129	2	13	142
10	4	142	5	13	155	3	227	4	26	253

Keterangan :

d : faktor pengenceran

C : jumlah koloni

ΣC : jumlah koloni total

hasil A (xa)	hasil B (xb)	ya = log10 (xa)	yb = log10 (xb)	(ya – yb)	(ya – yb)2
1,0,E+05	5,7,E+04	5,000	4,756	0,244	0,060
6,1,E+06	6,7,E+06	6,785	6,826	-0,041	0,002
1,7,E+06	8,5,E+05	6,230	5,929	0,301	0,091
2,6,E+07	1,4,E+07	7,415	7,146	0,269	0,072
4,5,E+07	1,3,E+07	7,653	7,114	0,539	0,291
1,3,E+06	1,2,E+06	6,114	6,079	0,035	0,001
9,1,E+03	1,3,E+04	3,959	4,114	-0,155	0,024
1,4,E+05	1,4,E+05	5,146	5,146	0,000	0,000
4,9,E+02	1,3,E+03	2,690	3,114	-0,424	0,180
1,4,E+06	2,3,E+05	6,149	5,362	0,787	0,620

Keterangan :

x : hasil akhir hitungan cawan (CFU/g)

y : log 10 (x) hasil akhir hitungan cawan (CFU/g)

∑(ya – yb)2 =	1,340
∑(ya – yb)2 /2n =	0,067
sIR =√ (∑(ya – yb)2 /2n) =	0,259

Jadi u_tech adalah 0,259

6.2.2. Penentuan Ketidakpastian Teknis Interlaboratory Validation

Pengggunaan standar deviasi reproducibility yang diturunkan dari perhitungan interlaboratory validation disarankan menjadi pilihan kedua setelah intralaboratory reproducibility. Penggunaan untuk penentuan ketidakpastian ini juga memiliki syarat yaitu digunakan jika repeatability dan reproducibility dari presisi metode intra laboratory tidak lebih besar dari nilai yang diperoleh dari interlaboratory validation.

6.2. Penentuan Ketidakpastian Matriks

Ketidakpastian matriks (u_Matrix) diperoleh dari standar deviasi repeatability (s_r) dari hasil akhir proses pengukuran pada matriks tertentu.

u_matrix = s_r

Terdapat tiga pendekatan dalam penentuan ketidakpastian matriks :

6.2.1. Penggunaan Nilai Tetap

Jenis matriks berupa cairan tidak kental dan encer yang homogen memiliki nilai ketidakpastian yang relatif rendah yaitu umumnya u_matriks = 0,1 log₁₀ CFU/g atau ml. Jika sampel dapat dihomogenisasi secara merata sebelum pengambilan porsi uji, maka nilai ketidakpastian matriks dapat bernilai 0,1 log₁₀. Teknik homogenisasi ini dapat berupa blending atau peristaltic homogenizer (ISO 19036: 2019, hal. 15).

6.2.2. Pengujian Porsi Uji.

Ketidakpastian matriks dapat juga ditentukan dengan mencari standar deviasi repeatability antar sampel dengan menganalisis sejumlah porsi uji pada kondisi yang sama sesuai bagan berikut.

Gambar 6. Bagan kerja penentuan ketidakpastian matriks dengan pengujian porsi uji. Diadaptasi dari “ISO 19036: 2019. Microbiology of the food chain – Estimation of Measurement Uncertainty for Quantitative Determination”, oleh ISO, 2019, hal. 15.

Lebih baik sampel tidak ditambahi kontaminasi buatan (ditambah analit) karena tidak merefleksikan kondisi mikroorganisme sebenarnya pada sampel. Kondisi analisis yang digunakan juga sebaiknya semaksimal mungkin identik untuk menghilangkan variabilitas teknis, misalnya memakai batch media yang sama, inkubator yang sama, hari yang sama atau analis yang sama.

Jumlah porsi uji yang diuji minimum 2 untuk setiap sampel dan jumlah total porsi uji yang dianalisis adalah paling tidak 10 dan lebih banyak dari jumlah sampel yang diuji. Tentunya semua sampel memiliki sampel matriks yang sama.

Misalnya :

• 10 sampel dengan diambil masing-masing 2 porsi uji (total 20).
• 5 sampel dengan diambil masing-masing 3 porsi uji (total 15).
• 2 sampel dengan diambil masing-masing 6 porsi uji (total 12)
• 1 sampel dengan diambil 11 porsi uji (total 11).

Berikut tahap-tahap perhitungannya :

Data yang didapatkan hasil A (x_a), B (x_b) dan C (x_c) lalu di hitung dengan rumus :

s_r = √ (Σ(mean y_ij – y_ij)² / Σ(n_i-1)) =

keterangan :

s_r : standar deviasi intralaboratory repeatability

i : indeks sampel laboratorium

j : indeks porsi uji

x_ij : hasil analisis (CFU/g atau ml)

y_ij : log₁₀ x_ij

mean y_ij : nilai rata-rata dari y_ij untuk setiap sampel

(mean y_{ij –} y_ij)² : selisih kuadrat dari mean y_ij dan y _ij

n_i-1 : derajat bebas

Contoh perhitungan untuk sejumlah sampel yang berbeda :

Jumlah sampel : 10

Jumlah porsi uji total : 26

i	j	xij	yij = log10 xij	mean yij	(mean yij – yij)2	ni-1
1	A	1,00,E+05	5,0000	5,0520	0,00271	2
1	B	5,73,E+04	4,7582		0,08636
1	C	2,50,E+05	5,3979		0,11965
2	A	6,09,E+06	6,7846	6,8063	0,00047	1
2	B	6,73,E+06	6,8280		0,00047
3	A	1,69,E+06	6,2279	6,1188	0,01189	3
3	B	8,45,E+05	5,9269		0,03685
3	C	9,73,E+05	5,9881		0,01709
3	D	2,15,E+06	6,3324		0,04563
4	A	2,65,E+07	7,4232	7,2878	0,01835	1
4	B	1,42,E+07	7,1523		0,01835
5	A	4,55,E+07	7,6580	7,3876	0,07310	1
5	B	1,31,E+07	7,1173		0,07310
6	A	1,28,E+06	6,1072	6,0840	0,00054	1
6	B	1,15,E+06	6,0607		0,00054
7	A	9,09,E+03	3,9586	4,0830	0,01549	2
7	B	1,31,E+04	4,1173		0,00117
7	C	1,49,E+04	4,1732		0,00813
8	A	1,38,E+05	5,1399	5,1491	0,00009	1
8	B	1,44,E+05	5,1584		0,00009
9	A	4,91,E+02	2,6911	2,9814	0,08430	3
9	B	1,29,E+03	3,1106		0,01668
9	C	8,64,E+02	2,9365		0,00202
9	D	1,54,E+03	3,1875		0,04247
10	A	1,41,E+06	6,1492	5,7555	0,15504	1
10	B	2,30,E+05	5,3617		0,15504

Σ(mean yij – yij)2 =	0,98563
Σ(ni-1) =	16
Σ(mean yij – yij)2 / Σ(ni-1) =	0,061602
sr = √ (Σ(mean yij – yij)2 / Σ(ni-1)) =	0,248197

Jadi u_matrix adalah 0,2482

6.2.3. Karakteristik yang Diketahui

Ketidakpastian matriks dapat juga diperoleh dari studi sebelumnya yaitu dapat berupa nilai ketidakpastian dari berbagai matriks sampel hasil validasi. Matriks yang memiliki kategori yang sama maka nilai ketidakpastiannya dapat disamakan. Pengkategorian matriks sampel ini harus sesuai dengan ISO 16140-3. Selain itu, ketidakpastian matriks yang diperoleh suatu laboratorium dapat digunakan oleh laboratorium lainnya asalkan jenis matriksnya sama sesuai kategori tersebut.

Tabel 1. Contoh kategorisasi salah satu jenis sampel (susu dan produk susu). Kategori lainnya tidak tercantum dalam tabel. Diadaptasi dari “ISO 16140-3: 2017. Microbiology of the food chain — Method validation — Part 3: Protocol for the verification of reference and validated alternative methods implemented in a single laboratory”, oleh ISO, 2017, Annex A.

kategori	tipe	contoh item
raw milk & dairy products	raw milk and/or fermented/acidified milks (not heat treated	raw milk
		raw fermented/acidified, raw milk yoghurts, raw dairy-based drinks
	raw milk based products with high fat content and/or high background microbiota	raw butters
		raw creams
		hard and semi-hard cheeses (e.g. Comte, Beaufort)
		blue cheeses (e.g. Raquefort)
		soft cheese (e.g. Brie, Munster)
heat-processed milk and dairy product	pasteurized dairy products	milk-based dessert, ice cream, drinks cream
	sterilized or UHT dairy products	UHT milks, canned milks or creams
	pasterurised milk-based products	fermented/acidified pasteurized milk, yoghurt, dairy-based products
		pasteurized milks
		butlers
		creams
		hand and semi-hard cheeses (heat processed)
		blue cheeses
		soft cheeses
	dry	milk powders
		powder for milk-based dessert
etc.

Berlanjut ke Bagian 3

Indra Pradhika, 2019