6.3. Penentuan Ketidakpastian Distribusional

6.3.1. Ketidakpastian Distribusional Metode Hitungan Cawan

Pada metode hitungan cawan terdapat dua ketidakpastian distribusional yaitu ketidakpastian Poisson dan konfirmasi. Ketidakpastian konfirmasi hanya berlaku jika metode memakai uji konfirmasi setelah uji presumtif.

6.3.1.1. Ketidakpastian Poisson

Ketidakpastian distribusional minimal yang ada tergantung kepada jumlah total koloni (ΣC) yang didapat. Tabel berikut memberikan informasi mengenai ketidakpastian standar Poisson (u_Poisson) dalam unit log₁₀ untuk jumlah koloni 1 sampai 40.

Tabel 2. Nilai u_Poisson dalam unit log₁₀ untuk jumlah koloni 1sampai 40. Diadaptasi dari “ISO 19036: 2019. Microbiology of the food chain – Estimation of Measurement Uncertainty for Quantitative Determination”, oleh ISO, 2019, hal. 17.

ΣC	uPoisson	ΣC	uPoisson	ΣC	uPoisson	ΣC	uPoisson
1	0,434	11	0,131	21	0,095	31	0,078
2	0,307	12	0,125	22	0,093	32	0,077
3	0,251	13	0,120	23	0,091	33	0,076
4	0,217	14	0,116	24	0,089	34	0,074
5	0,194	15	0,112	25	0,087	35	0,073
6	0,177	16	0,109	26	0,085	36	0,072
7	0,164	17	0,105	27	0,084	37	0,071
8	0,154	18	0,102	28	0,082	38	0,070
9	0,145	19	0,100	29	0,081	39	0,070
10	0,137	20	0,097	30	0,079	40	0,069

Jika ΣC = 0, maka u_Poisson = 0,4343

Namun jika ΣC lebih dari 40 maka dapat dihitung dengan rumus :

u_Poisson = (1/ln(10)) / (√ΣC)

u_Poisson = 0,4343 / (√ΣC)

Contoh :

jika ΣC = 100, maka

u_Poisson = 0,4343/ (√100)

u_Poisson = 0,4343/ (10)

u_Poisson = 0,04343

6.3.1.2. Ketidakpastian Konfirmasi

Uji konfirmasi untuk mengkoreksi uji presumptif dalam metode hitungan cawan juga memberikan efek ketidakpastian. Ketidakpastian ini dapat dicari dengan rumus :

u_conf = 1/2,303.√((n_c+0,5)(n_p-n_c+0,5)n_p²)/((n_p+1)2(n_p+2)n_c²)

keterangan :

n_p : jumlah koloni presumptif yang diuji,

n_c : jumlah koloni terkonfirmasi

jika n_c = 0, maka u_conf dihitung sama seperti jika n_c =1

Untuk memdudahkan berikut tabel nilai u_Conf untuk beberapa angka tertentu.

Tabel 3. Nilai u_conf untuk beberapa angka tertentu (dalam log₁₀). Diadaptasi dari “ISO 19036: 2019. Microbiology of the food chain – Estimation of Measurement Uncertainty for Quantitative Determination”, oleh ISO, 2019, hal. 18.

nc	np
	5	10	15	20
1	0,35533	0,43016	0,46045	0,47684
2	0,20228	0,26265	0,28679	0,29980
3	0,13485	0,19461	0,21768	0,23000
4	0,08883	0,15407	0,17756	0,18993
5	0,04536	0,12535	0,15006	0,16281
6		0,10272	0,12931	0,14266
7		0,08340	0,11261	0,12674
8		0,06566	0,09854	0,11360
9		0,04780	0,08620	0,10239
10		0,02611	0,07503	0,09258
11			0,06457	0,08378
12			0,05442	0,07573
13			0,04412	0,06824
14			0,03289	0,06114
15			0,01832	0,05427
16				0,04748
17				0,04059
18				0,03331
19				0,02510
20				0,01411

Semakin tinggi jumlah yang terkonfirmasi maka ketidakpastiannya semakin rendah. Semakin besar jumlah koloni yang diuji semakin rendah juga ketidakpastiannya.

Contoh :

n_p : 10 koloni

n_c : 4 koloni

u_conf = 1/2,303.√((n_c+0,5)(n_p-n_c+0,5)n_p²)/((n_p+1)2(n_p+2)n_c²)

= 1/2,303.√((4+0,5)(10-4+0,5)10²)/((10+1)2(10+2)4²)

= 0,15407 (dalam log₁₀)

6.3.2. Ketidakpastian Distribusional Metode MPN

Ketidakpastian MPN memiliki nilai yang lebih besar daripada ketidakpastian Poisson karena adanya unsur probabilitas binomial yang berhubungan dengan hasil positif atau negatif tabung. Ketidakpastian standar MPN juga disebut sebagai standar eror diekspresikan dengan satuan log₁₀ MPN/g atau MPN/ml.

u_MPN = (1/(ln(10)) / µ√Σ((x_i.m_i².exp(-m_i.µ))/(1-exp(-m_i.µ)²)

uMPN : ketidakpastian distribusional MPN

µ : nilai MPN/g atau ml, bukan dalam log₁₀

x_i : jumlah hasil positif pada pengenceran ke-i

m_i : jumlah sampel (g atau ml) setiap pengenceran ke-i

k : jumlah pengenceran

‘exp’ adalah bukan notasi namun operasi matematika yaitu e^x atau inversi ln x. Konstanta e adalah 2,71828182845904. Jika menggunakan Excel^® maka dapat menggunakan fungsi “=EXP”.

Jika Σx_i = 0 atau tidak ada hasil positif di setiap pengenceran, maka u_MPN dihitung dengan menganggap adanya 1 tabung positif pada pengenceran terrendah (terkonsentrasi).

Contoh :

MPN 5×3 tabung dengan hasil positif 4-0-1 dan indeks MPN = 1,7 MPN/g

mi	xi	((xi.mi2.exp(-mi.µ))/(1-exp(-mi.µ)2)
1	4	1,093903
0,1	0	0
0,01	1	0,346012
	Σ =	1,439916

µ =	1,7	MPN/g
1/ln(10) =	0,434294
uMPN =	0,212896	log10 MPN/g

Jika rumus diatas digunakan untuk menghitung data pada tabel MPN 3×3 dengan inokulum 1, 0,1 dan 0,01 g maka didapatkan data ketidakpastian MPN sebagai berikut.

Tabel 4. MPN 3×3 tabung dengan inokulum 1, 0,1 dan 0,01 g beserta nilai ketidakpastian MPN (u_MPN). Diambil dari dokumentasi pribadi.

Tabung positif			µ (MPN/g)	uMPN (log10 MPN/g)
1	0,1	0,01
0	0	0	<0,3	0,437
0	0	1	0,3	0,434
0	1	0	0,3	0,434
0	1	1	0,61	0,307
0	2	0	0,62	0,307
0	3	0	0,94	0,251
1	0	0	0,36	0,437
1	0	1	0,72	0,310
1	0	2	1,1	0,255
1	1	0	0,74	0,311
1	1	1	1,1	0,255
1	2	0	1,1	0,255
1	2	1	1,5	0,222
1	3	0	1,6	0,223
2	0	0	0,92	0,318
2	0	1	1,4	0,264
2	0	2	2	0,234
2	1	0	1,5	0,266
2	1	1	2	0,234
2	1	2	2,7	0,214
2	2	0	2,1	0,236
2	2	1	2,8	0,215
2	2	2	3,5	0,199
2	3	0	2,9	0,217
2	3	1	3,6	0,200
3	0	0	2,3	0,310
3	0	1	3,8	0,306
3	0	2	6,4	0,293
3	1	0	4,3	0,328
3	1	1	7,5	0,304
3	1	2	12	0,256
3	1	3	16	0,223
3	2	0	9,3	0,316
3	2	1	15	0,266
3	2	2	21	0,236
3	2	3	29	0,217
3	3	0	24	0,315
3	3	1	46	0,340
3	3	2	110	0,322

Sedangkan jika rumus diatas digunakan untuk menghitung data pada tabel MPN 5×3 dengan inokulum 0,1, 0,01 dan 0,001 g maka didapatkan data ketidakpastian MPN sebagai berikut.

Tabel 5. MPN 5×3 tabung dengan inokulum 0,1, 0,01 dan 0,001 g beserta nilai ketidakpastian MPN (u_MPN). Diambil dari dokumentasi pribadi.

Tabung positif			µ	uMPN	Tabung positif			µ	uMPN
0,1	0,01	0,001			0,1	0,01	0,001
0	0	0	<1,8	0,435	4	0	2	21	0,198
0	0	1	1,8	0,434	4	0	3	25	0,186
0	1	0	1,8	0,434	4	1	0	17	0,213
0	1	1	3,6	0,307	4	1	1	21	0,198
0	2	0	3,7	0,307	4	1	2	26	0,188
0	2	1	5,5	0,251	4	1	3	31	0,179
0	3	0	5,6	0,251	4	2	0	22	0,200
1	0	0	2	0,435	4	2	1	26	0,188
1	0	1	4	0,308	4	2	2	32	0,180
1	0	2	6	0,252	4	2	3	38	0,173
1	1	0	4	0,308	4	3	0	27	0,190
1	1	1	6,1	0,252	4	3	1	33	0,182
1	1	2	8,1	0,219	4	3	2	39	0,174
1	2	0	6,1	0,252	4	4	0	34	0,183
1	2	1	8,2	0,219	4	4	1	40	0,175
1	3	0	8,3	0,219	4	4	2	47	0,167
1	3	1	10	0,196	4	5	0	41	0,176
1	4	0	11	0,196	4	5	1	48	0,168
2	0	0	4,5	0,310	5	0	0	23	0,240
2	0	1	6,8	0,254	5	0	1	31	0,236
2	0	2	9,1	0,221	5	0	2	43	0,239
2	1	0	6,8	0,254	5	0	3	58	0,232
2	1	1	9,2	0,221	5	1	0	33	0,244
2	1	2	12	0,199	5	1	1	46	0,248
2	2	0	9,3	0,221	5	1	2	63	0,238
2	2	1	12	0,199	5	1	3	84	0,217
2	2	2	14	0,182	5	2	0	49	0,256
2	3	0	12	0,199	5	2	1	70	0,245
2	3	1	14	0,182	5	2	2	94	0,220
2	4	0	15	0,183	5	2	3	120	0,199
3	0	0	7,8	0,257	5	2	4	150	0,183
3	0	1	11	0,225	5	3	0	79	0,252
3	0	2	13	0,202	5	3	1	110	0,225
3	1	0	11	0,225	5	3	2	140	0,204
3	1	1	14	0,204	5	3	3	180	0,189
3	1	2	17	0,187	5	3	4	210	0,176
3	2	0	14	0,204	5	4	0	130	0,233
3	2	1	17	0,187	5	4	1	170	0,213
3	2	2	20	0,175	5	4	2	220	0,200
3	3	0	17	0,188	5	4	3	280	0,192
3	3	1	21	0,176	5	4	4	350	0,185
3	3	2	24	0,166	5	4	5	430	0,178
3	4	0	21	0,176	5	5	0	240	0,244
3	4	1	24	0,166	5	5	1	350	0,253
3	5	0	25	0,167	5	5	2	540	0,268
4	0	0	13	0,233	5	5	3	920	0,258
4	0	1	17	0,213	5	5	4	1600	0,241

6.4. Penentuan Ketidakpastian Dikombinasi

Ketidakpastian dikombinasi adalah penggabungan dari setiap ketidakpastian standar yang berpengaruh terhadap analisis.

6.4.1. Kombinasi dari Ketidakpastian Standar Terpisah

Kombinasi ini dihitung dengan menggabungkan setiap ketidakpastian standar dengan rumus umum berikut.

u_c(y) = √ u_a²+u_b²+u_c²

u_c(y) : ketidakpastian dikombinasi

u_a,b,c : ketidakpastian standar (dapat berupa u_tech, u_matrix dll.)

Efek dari suatu ketidakpastian standar dapat diabaikan jika perbandingan ketidakpastian standar tersebut dengan ketidakpastian standar terbesar tidak lebih dari 1/5. Umumnya nilai terbesar dimiliki oleh u_tech sehingga jika ketidakpastian standar lain sangat kecil dan dapat diabaikan maka u_c(y) = u_tech.

6.4.1.1. Untuk Metode Hitungan Cawan tanpa Uji Konfirmasi

Metode yang dicakupi umumnya memakai media non spesifik (spread plate, pour plate atau filtrasi membran), diantaranya adalah metode APC dan yeast & mold. Ketidakpastian standar yang perlu dimasukkan adalah :

u_c (y) = √ u_tech²+u_matrix²+u_Poisson²

6.4.1.2. Untuk Metode Hitungan Cawan dengan Uji Konfirmasi

Metode yang dicakupi umumnya memakai media spesifik (spread plate, pour plate atau filtrasi membran), diantaranya metode perhitungan adalah S.aureus, C.perfringens, E.coli dll. Ketidakpastian standar yang perlu dimasukkan adalah :

u_c (y) = √ u_tech²+u_matrix²+u_Poisson²+u_conf²

6.4.1.3. Untuk Metode MPN

Dipakai untuk metode MPN semua seri dan kombinasi. Perlu diingat, metode MPN umumnya memakai uji konfirmasi, tetapi tidak dibutuhkan untuk menambahkan u_conf. Ketidakpastian standar yang perlu dimasukkan adalah :

u_c (y) = √ u_tech²+u_matrix²+u_MPN²

6.4.1.4. Untuk Metode Mikrobiologi Instrumental

Dipakai untuk metode mikrobiologi tanpa perhitungan koloni, seperti ATP bioluminescence. Ketidakpastian standar yang perlu dimasukkan adalah :

u_c (y) = √ u_tech²+u_matrix²

6.4.2. Kombinasi Berdasarkan Standar Deviasi Reproducibility

Jalan ini dapat dipilih jika sesuai dengan kebutuhan pelanggan atau protokol laboratorium tertentu. Nilai standar deviasi reproducibility saja dapat langsung menjadi ketidakpastian dikombinasi, dengan rumus :

u_c (y) = s_R

6.7. Penentuan Ketidakpastian Diperluas

Ketidakpastan diperluas dihitung dari ketidakpastian dikombinasi dengan rumus :

U = k.u_c (y)

k : adalah faktor cakupan (coverage factor), umumnya digunakan nilai 2 dengan tingkat kepercayaan 95%.

Nilai ketidakpastian diperluas ini sebaiknya memiliki 2 angka signifikan.

7. Pelaporan Estimasi Ketidakpastian Pengukuran

7.1. Pelaporan Ketidakpastian Jika Hasil diatas LOQ

Setelah didapatkan ketidakpastian diperluas, maka nilai tersebut dapat disertakan dalam pelaporan akhir hasil analisis. Beberapa bentuk pelaporan ketidakpastian pengukuran yang disarankan adalah:

• y ± U log₁₀ (CFU/g atau CFU/ml)

misal : 5,0 ± 0,31 log₁₀ CFU/g

• y log₁₀ (CFU/g atau CFU/ml) [y- U; y+U]

misal : 5,0 log₁₀ CFU/g [4,69; 5,31]

• x (CFU/g atau CFU/ml) [10 ^{y- U}; 10 ^y+U]

misal : 1 x 10⁵ CFU/g [4,9 x 10⁴; 2,0 x 10⁵]

Contoh Perhitungan :

Misalnya dalam suatu analisis menggunakan metode APC pada sosis, didapatkan data :

103	104	ΣC	x
102	8	110	(110/1,1)x103 = 1×105

u_tech = 0,259 log₁₀ CFU/g

(dari contoh perhitungan intralaboratory reproducibility).

u_matrix = 0,2482 log₁₀ CFU/g

(dari contoh perhitungan pengujian porsi uji).

u_Poisson = 0,4343/√ ΣC

= 0,4343/√110

= 0,0414 log₁₀ CFU/g

u_Poisson /u_tech

= 0,0414/0,259

=.0,276 (> 0,2)

maka u_Poisson tidak diabaikan

u_c (y) = √ u_tech²+u_matrix²+u_Poisson²

= √ 0,259²+0,2482²+0,0414²

= √ 0,1303982

= 0,361106909

U = k.u_c (y)

= 2. 0,361106909

= 0,722213819

= 0,72 log₁₀ CFU/g (diambil 2 angka penting)

Pelaporan = y ± U log₁₀ CFU/g

= 1×10⁵ CFU/g ± 0,72 log₁₀ CFU/g

= 1×10⁵ ± 5,24 CFU/g

= 5,0 ± 0,72 log₁₀ CFU/g

7.2. Pelaporan Ketidakpastian Jika Hasil dibawah LOQ

Hasil analisis disebut dibawah LOQ jika:

ΣC = 0, tidak ada koloni dihitung untuk hitungan cawan

n_c = 0, tidak ada koloni terkonfirmasi untuk hitungan cawan

x_i = 0, untuk semua i, atau tidak ada tabung positif untuk MPN

Maka pelaporannya menjadi :

• < y_LOQ ± U log₁₀ (CFU/g atau CFU/ml)
• < y_LOQ log₁₀ (CFU/g atau CFU/ml) [<y_LOQ-U; y_LOQ+U]
• < x_LOQ (CFU/g atau CFU/ml) [0; 10 ^yLOQ+U]

x_LOQ : nilai LOQ dalam CFU/g atau CFU/ml

Contoh Perhitungan :

Misalnya dalam suatu analisis menggunakan metode APC pada sosis, didapatkan data :

103	104	ΣC	x
0	0	0	(1/1,1)x101

u_tech = 0,15 log₁₀ CFU/g

u_matrix = 0,10 log₁₀ CFU/g

u_Poisson = 0,4343/√ ΣC

= 0,4343/√ 1

= 0,0434 log₁₀ CFU/g

u_c (y) = √ u_tech²+u_matrix²+u_Poisson²

= √ 0,15²+0,10²+0,0434²

= √ 0,2209

= 0,470

U = k.u_c (y)

= 2. 0,470

= 0,94 log₁₀ CFU/g

x_LOQ dihitung dari satu koloni yang dihitung sehingga ΣC =1.

x_LOQ = 10^d1 (ΣC/1,1)

= 10¹ (1/1,1)

= 9,091 CFU/g

y_LOQ = log₁₀ (9,091)

= 0,959 log₁₀ CFU/g.

Pelaporan = < y_LOQ ± U

= < 0,96 ± 0,94 log₁₀ CFU/g.

Referensi

ISO 16140-3: 2017. (2017). Microbiology of the food chain — Method validation — Part 3: Protocol for the verification of reference and validated alternative methods implemented in a single laboratory

ISO 19036: 2019. (2019). Microbiology of the food chain – Estimation of Measurement Uncertainty for Quantitative Determination.

KAN G-01 (2011). Guide on Measurement Uncertainty

Indra Pradhika, 2019.